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陈雪123

铁虫 (初入文坛)

[求助] SDS-PAGE后,考染有条带,WB后检测不到目的蛋白。 已有5人参与

最近在做WB,目的蛋白大小在21.5 kD。却总是检测不到目的蛋白。可能是因为蛋白浓度太低了。搜了一下,浓缩方法有很多。不知道该选择什么方法?现在有4 mL蛋白。
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有生之年,做最好的自己,不留遗憾。
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
考染出来的条带也不一定就是你的目的蛋白。你蛋白浓度是多少?上样多大体积。如果浓缩,用冷冻干燥。
2楼2014-08-25 12:10:37
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陈雪123

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-08-25 12:10:37
考染出来的条带也不一定就是你的目的蛋白。你蛋白浓度是多少?上样多大体积。如果浓缩,用冷冻干燥。

蛋白浓度没有测定,20 μL蛋白上样缓冲液加80 μL蛋白煮沸10 min。上样5 μL,也有一次上样10 μL。冷冻干燥的话,俺们没有冷冻干燥器。还有其他办法吗?在不损失蛋白的情况下。
有生之年,做最好的自己,不留遗憾。
3楼2014-08-25 12:31:22
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 陈雪123 at 2014-08-25 12:31:22
蛋白浓度没有测定,20 μL蛋白上样缓冲液加80 μL蛋白煮沸10 min。上样5 μL,也有一次上样10 μL。冷冻干燥的话,俺们没有冷冻干燥器。还有其他办法吗?在不损失蛋白的情况下。...

建议测个蛋白浓度。我没想出除冷冻干燥外还有什么好的办法。下次提蛋白时把细胞多弄点裂解。
4楼2014-08-25 16:52:35
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ahhngwj

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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你确定你目的抗体没有问题么?或者是抗体出问题了,抓不出条带也有可能
5楼2014-08-26 08:43:43
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帖航

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你考染都出来条带了,我觉得是你WB出了问题,首先是转膜确定转过去了,做WB电泳胶约薄越好,另外你的抗体有没有问题,还有你确定那蛋白是你要的蛋白吗,不能光靠分子量确定是不是你的蛋白,要不然你做WB干什么,如果你就想浓缩,简单的用透析袋,或者超滤。
6楼2014-08-26 10:55:59
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果仅仅是浓缩蛋白质,还是先用超滤,在进行低温冻干。
7楼2015-06-24 15:50:33
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qq263671900

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你首先考虑的不是浓缩蛋白,一般情况下,如果sds能看见满意的带,说明蛋白浓度是可以开始wb的,我建议你仔细想想你的wb操作,最好的办法就是加一个positive control在里面,确认wb环节没有问题
8楼2015-06-26 07:01:11
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