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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » SDS-PAGE后，考染有条带，WB后检测不到目的蛋白。
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陈雪123

铁虫 (初入文坛)

[求助] SDS-PAGE后，考染有条带，WB后检测不到目的蛋白。 已有5人参与

最近在做WB，目的蛋白大小在21.5 kD。却总是检测不到目的蛋白。可能是因为蛋白浓度太低了。搜了一下，浓缩方法有很多。不知道该选择什么方法？现在有4 mL蛋白。
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有生之年，做最好的自己，不留遗憾。
1楼 2014-08-25 10:14:05
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
考染出来的条带也不一定就是你的目的蛋白。你蛋白浓度是多少？上样多大体积。如果浓缩，用冷冻干燥。
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2楼2014-08-25 12:10:37
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陈雪123

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-08-25 12:10:37
考染出来的条带也不一定就是你的目的蛋白。你蛋白浓度是多少？上样多大体积。如果浓缩，用冷冻干燥。

蛋白浓度没有测定，20 μL蛋白上样缓冲液加80 μL蛋白煮沸10 min。上样5 μL，也有一次上样10 μL。冷冻干燥的话，俺们没有冷冻干燥器。还有其他办法吗？在不损失蛋白的情况下。
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有生之年，做最好的自己，不留遗憾。
3楼2014-08-25 12:31:22
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 陈雪123 at 2014-08-25 12:31:22
蛋白浓度没有测定，20 μL蛋白上样缓冲液加80 μL蛋白煮沸10 min。上样5 μL，也有一次上样10 μL。冷冻干燥的话，俺们没有冷冻干燥器。还有其他办法吗？在不损失蛋白的情况下。...

建议测个蛋白浓度。我没想出除冷冻干燥外还有什么好的办法。下次提蛋白时把细胞多弄点裂解。
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4楼2014-08-25 16:52:35
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ahhngwj

木虫 (小有名气)

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你确定你目的抗体没有问题么？或者是抗体出问题了，抓不出条带也有可能
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5楼2014-08-26 08:43:43
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帖航

银虫 (小有名气)

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你考染都出来条带了，我觉得是你WB出了问题，首先是转膜确定转过去了，做WB电泳胶约薄越好，另外你的抗体有没有问题，还有你确定那蛋白是你要的蛋白吗，不能光靠分子量确定是不是你的蛋白，要不然你做WB干什么，如果你就想浓缩，简单的用透析袋，或者超滤。
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6楼2014-08-26 10:55:59
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calorimetry

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果仅仅是浓缩蛋白质，还是先用超滤，在进行低温冻干。
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7楼2015-06-24 15:50:33
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qq263671900

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你首先考虑的不是浓缩蛋白，一般情况下，如果sds能看见满意的带，说明蛋白浓度是可以开始wb的，我建议你仔细想想你的wb操作，最好的办法就是加一个positive control在里面，确认wb环节没有问题
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8楼2015-06-26 07:01:11
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