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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS-PAGE凝胶电泳跑出来的条带问题
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樱花稀砂

新虫 (初入文坛)

[求助] SDS-PAGE凝胶电泳跑出来的条带问题

做的是娃哈哈乳饮料的蛋白质测定，直接从买来的乳饮料中取样跑电泳。用的是15%的分离胶和5%的浓缩胶，但是跑出来的marker只有三条带，而且颜色非常淡，样品跑出来条带拖尾，非常不理想，请问是什么原因呢？？？求指导那，跑了三四次都这样，试剂溶液都是新配的，marker也是新买的。
SDS-PAGE凝胶电泳跑出来的条带问题
201307243056.jpg
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1楼 2013-07-27 17:24:34
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spaceman_jia

捐助贵宾 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-29 11:10:52
gyesang: 回帖置顶 2013-07-29 11:10:54
引用回帖:
10楼: Originally posted by 樱花稀砂 at 2013-07-28 13:23:07
可以请教一下配胶的方案吗？我怕我的错了，按方案上的AP和TEMED的量胶总是不凝，多加了才能凝...

貌似protocol应该没有区别。
关键AP要新配，附件中等20min让分离胶初步凝固已经算保守了。
我通常整块胶1个小时左右就完成了（10x8cm小胶，0.75或1mm厚不到一个小时，1.5mm厚会多等等），也可妥善保存过夜再用但不推荐。
加大用量会让聚合度下降，尽管可以凝固。
我喜欢现用现配，上午制胶跑胶，下午可以染色(快染法2hr就出结果）或Western。
如果用旧的AP通常要凝结好几个小时，甚至过夜，而且效果会变差。
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  • 附件 1 : Protocol#1-SDS-PAG(1).pdf
    • 2013-07-28 13:45:31, 96.83 K
11楼2013-07-28 14:19:00
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spaceman_jia

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-27 22:17:16
樱花稀砂: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-07-28 19:11:17
你的染色看起来怪怪的，是G-250吗
别直接用饮料原液，跑蛋白样品需要纯化。可以选多种方法，如TCA沉淀，稀释后超滤离心等。电泳之前测一下浓度再上样。
关于marker，你可以跑一个空胶，只上marker看看。如果电泳本身ok，没有样品的情况下，marker可能会宽一些，但其他都应该正常。
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2楼2013-07-27 21:05:59
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-27 22:17:26
ladder很淡，应该是load量不够，至于样品拖尾的话，一般可以降低电压，信新配running buffer来避免！
Good luck
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互助互励，共奋共进！！
3楼2013-07-27 21:21:53
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樱花稀砂

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-27 21:21:53
ladder很淡，应该是load量不够，至于样品拖尾的话，一般可以降低电压，信新配running buffer来避免！
Good luck

ok,谢谢哦
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4楼2013-07-27 21:48:43
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樱花稀砂

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by spaceman_jia at 2013-07-27 21:05:59
你的染色看起来怪怪的，是G-250吗
别直接用饮料原液，跑蛋白样品需要纯化。可以选多种方法，如TCA沉淀，稀释后超滤离心等。电泳之前测一下浓度再上样。
关于marker，你可以跑一个空胶，只上marker看看。如果电泳本 ...

染色用的是G-250的，染色液重新配会不会好点呢？电泳之前测浓度,这是怎么测的呢？配胶时AP和TEMED多加几倍，会有影响吗？
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5楼2013-07-27 21:54:47
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spaceman_jia

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-27 22:17:40
引用回帖:
5楼: Originally posted by 樱花稀砂 at 2013-07-27 21:54:47
染色用的是G-250的，染色液重新配会不会好点呢？电泳之前测浓度,这是怎么测的呢？配胶时AP和TEMED多加几倍，会有影响吗？...

染色液重配一下吧，颜色太浅了。
AP，TEMED不要多加，用量严格按照protocol
我个人习惯都是用新配的试剂盒缓冲液，包括AP都是从固体新配的，电泳缓冲液也不重复用。
可能极端了一点，但效果很好。
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6楼2013-07-27 22:05:18
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spaceman_jia

捐助贵宾 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩 2013-07-27 22:17:50
蛋白浓度测定都是基于比色，如bradford法，lowrey法等，你可查查常见的方法书。
也有试剂盒卖。
还有一种用G-250配置标准曲线的方法，可以实验室自行配置，试剂简单。很常见，网上或方法书上总会有。
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7楼2013-07-27 22:09:36
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冷眼倦天涯

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-07-29 11:10:36
拖尾应该是电压问题，你的电压是多少？都是新配的试剂AP，TEMED的量注意一下，查一下相关文献试试看。
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8楼2013-07-28 10:54:41
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樱花稀砂

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冷眼倦天涯 at 2013-07-28 10:54:41
拖尾应该是电压问题，你的电压是多少？都是新配的试剂AP，TEMED的量注意一下，查一下相关文献试试看。

浓缩胶的时候电压是10Am，分离胶的时候电压是20Am，高了吗?
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9楼2013-07-28 11:29:18
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樱花稀砂

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by spaceman_jia at 2013-07-27 22:05:18
染色液重配一下吧，颜色太浅了。
AP，TEMED不要多加，用量严格按照protocol
我个人习惯都是用新配的试剂盒缓冲液，包括AP都是从固体新配的，电泳缓冲液也不重复用。
可能极端了一点，但效果很好。...

可以请教一下配胶的方案吗？我怕我的错了，按方案上的AP和TEMED的量胶总是不凝，多加了才能凝
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10楼2013-07-28 13:23:07
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