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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » wb，条带异常，拖尾，弥散。
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lxy19870124

铁虫 (初入文坛)

[求助] wb，条带异常，拖尾，弥散。 已有2人参与

我崩溃了，做了很多次都是这样子的，不知道什么原因，上图！！！[img]

就这熊样



条带中空



背景很深，我是挑不深的上的



无语
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遇到问题，解决问题。
1楼 2011-11-17 15:24:26
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lxy19870124

铁虫 (初入文坛)
附加说明：我用的是10％的胶，条带每次出来都跟彗星一样，最显著的是条带两边像流泪一样，很着急，大家给帮忙，在线等！！！！！！！！！！！
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遇到问题，解决问题。
2楼2011-11-17 15:26:53
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lxy19870124

铁虫 (初入文坛)
3楼2011-11-17 15:30:08
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2011加油

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-11-18 19:31:00
条带中空，很大可能是在压片前，盖保鲜薄膜时有气泡引起的。注意把保鲜膜捋平。

条带拖尾确实很严重，是不是浓缩胶的长度不够，下回可试一试将浓缩胶的长度制得长一些，将蛋白更好地浓缩；或者根据你的蛋白分子量，看看选择的分离胶比例是否合适了，太稀时对蛋白可能有点弥散，所以选择分离胶的比例也很重要。背景较高，可以再适当调整一下一抗二抗的稀释度或者延长封闭时间、洗膜时间或增加洗膜次数，另外，曝光的时间可再缩短一些。祝你下回实验成功。
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每天都是新开始，2011，要好好努力！
4楼2011-11-17 19:18:55
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zengmud2

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-11-18 19:31:10
楼主可从以下方面考虑改进
1. 浓缩胶的长度不够
2. 分离胶浓度偏低
3. 跑胶电压过高
4. 检查转膜时有无带动凝胶和膜的相对位移因素
5. 显影时间过长
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5楼2011-11-17 21:11:24
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luxy

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-11-18 19:31:25
凝胶的配置很重要，浓缩胶的长度，凝固的时间，都有影响。根据条带来看上样量可以适当减少。此外曝光时间需要多摸索一下，根据条带的亮度和荧光淬灭的时间，曝光时间的掌控也非常重要。祝你顺利！
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开题结束，问题多多，怎么办啊
6楼2011-11-18 11:53:37
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风雨祭

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果你的胶跑时Marker也有拖尾，那问题出在电泳，很可能是体系的pH有问题，建议重配电泳液、重配配胶的Tris缓冲液，或者整套试剂重配。

如果Marker没有问题，那问题还可能出在样品上，首先减少样品的上样量，条带中空的部分可能是样品量过大、光淬灭导致的。其次拖尾多半是样品溶解性不好，你的样品是不是组织蛋白？或者细胞量很大？将你的样品稀释1倍，并且补加相应的Loadingbuffer，再次进行超声破碎，可以改善大部分的溶解性问题。
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7楼2013-12-22 13:31:28
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

可能在电泳和免疫印迹两方面都有问题。

一、SDS PAGE电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-7)

1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100μL。
2.原因二：样品溶解不完全。
对策：
（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。

“一”的问题应该是说主要的。可能有WB背景高的问题，但是不明显。

二、WB背景高的可能原因与解决方法（可能不是原因或者主要原因）

1.洗膜不充分，增加洗涤液的体积和洗涤次数；在洗涤液中加入Tween=20。
2.二抗浓度过高，引起了一些非专一性的抗原-抗体相互作用，适当降低二抗浓度，可以分梯度进行。
3.二抗的识别抗原免疫簇不唯一，这是因为二抗是多克隆抗体，使用单克隆抗体的二抗，此时二抗的识别抗原免疫簇是唯一的，其非专一性的抗原-抗体相互作用会大为减少。当然，有时，单克隆抗体也会有识别抗原免疫簇不唯一，如果两种蛋白质的抗原免疫簇的结构很相近的话。如果不知道是不是二抗的识别抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情况下只加二抗实验，可以检测出是否为二抗的的抗原免疫簇的识别的原因，若是的话，可以先更换封闭试剂，若无效，则要同时更换二抗。
4.封闭不充分，增加封闭液的封闭时间，适当提高温度，更换封闭液。
5.曝光过度，缩短曝光时间。
6.检测过程中膜干燥，保持充分的反应液，避免膜干燥。
7．若无别的选择，可尝试选择5%的脱脂奶粉，同时加入Tween=20。
8.滴定一抗或二抗的效价，找到一个产生清晰的信号强度可以接受的较低的抗体浓度。
9.缩短一抗和二抗的孵育时间。
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8楼2014-07-18 10:58:04
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神秘旅游2836

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-07-18 10:58:04
可能在电泳和免疫印迹两方面都有问题。

一、SDS PAGE电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(2013-10-7)

1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10 ...

请教下做内参同样的东西别人做能做出很漂亮的条带，可是过两天我做的时候条带不明显，有时还有只显出来一点是怎么回事？会有哪些方面出问题？谢谢
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9楼2015-04-01 14:15:06
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