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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » WB扫膜出现背景深且有些条带呈白亮状是怎么回事？
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herjasmine

新虫 (初入文坛)

[求助] WB扫膜出现背景深且有些条带呈白亮状是怎么回事？已有3人参与

之前做的一直很好。最近老是出现背景很深而有杂带的情况，膜上还有些条带白的发亮，也不知道是不是目标条带（杂带太多）。且换了抗体后还是会出现这样的问题，而实验室有其他老师做出来也是这样的情况（做的抗体和蛋白都不同）。大家认为可能是什么原因造成的呢？
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1楼2014-03-28 20:32:51
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
图上来瞅瞅,白色条带可能是浓度太高底物都用完了,
也可能就是什么都没有,只是你曝光时间特别长
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2014-03-28 21:48:29
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然是整个实验室都是这种情况，可以从以下几个方面考虑：
1. 可能是封闭不够，是不是封闭液过期了，换换试试看看效果会不会好点。
2. 洗脱液有问题，重新配置TBST，看是不是PH值有问题，或者是没有加Tween。
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3楼2014-03-28 22:41:28
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herjasmine

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-03-28 22:41:28
既然是整个实验室都是这种情况，可以从以下几个方面考虑：
1. 可能是封闭不够，是不是封闭液过期了，换换试试看看效果会不会好点。
2. 洗脱液有问题，重新配置TBST，看是不是PH值有问题，或者是没有加Tween。

封闭液和洗脱液都重新配的。
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4楼2014-03-29 09:58:57
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herjasmine

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2014-03-28 21:48:29
图上来瞅瞅,白色条带可能是浓度太高底物都用完了,
也可能就是什么都没有,只是你曝光时间特别长

曝光时间不长，5s后出现的图片上就显示特别亮的条带，就像PCR那种条带一样。应该不是没有。另外黑色的杂带也比较多。
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5楼2014-03-29 10:25:18
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

WB背景高的可能原因与解决方法

1.洗膜不充分，增加洗涤液的体积和洗涤次数；在洗涤液中加入Tween=20。
2.二抗浓度过高，引起了一些非专一性的抗原-抗体相互作用，适当降低二抗浓度，可以分梯度进行。
3.二抗的识别抗原免疫簇不唯一，这是因为二抗是多克隆抗体，使用单克隆抗体的二抗，此时二抗的识别抗原免疫簇是唯一的，其非专一性的抗原-抗体相互作用会大为减少。当然，有时，单克隆抗体也会有识别抗原免疫簇不唯一，如果两种蛋白质的抗原免疫簇的结构很相近的话。如果不知道是不是二抗的识别抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情况下只加二抗实验，可以检测出是否为二抗的的抗原免疫簇的识别的原因，若是的话，可以先更换封闭试剂，若无效，则要同时更换二抗。
4.封闭不充分，增加封闭液的封闭时间，适当提高温度，更换封闭液。
5.曝光过度，缩短曝光时间。
6.检测过程中膜干燥，保持充分的反应液，避免膜干燥。
7．若无别的选择，可尝试选择5%的脱脂奶粉，同时加入Tween=20。
8.滴定一抗或二抗的效价，找到一个产生清晰的信号强度可以接受的较低的抗体浓度。
9.缩短一抗和二抗的孵育时间。
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6楼2014-07-18 10:28:46
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

WB出现白斑是因为转膜过程有气泡存在；或者抗体的分布不均匀，孵育抗体时要使用摇床。
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7楼2014-07-18 10:29:13
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

WB出现非特异性条带的原因与解决方法：
1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度。
2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体。
3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。
4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量。
5.样品蛋白质发生了降解，降解产物成为了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是单克隆抗体时更为明显；避免对样品蛋白质反复冻融，食用新鲜的蛋白质样品，可以使用蛋白酶的广谱抑制剂（已经有商用产品），必要的话使用分子筛层析或HPLC纯化蛋白质样品后再上样（HPLC不能用于蛋白质制备，不过用做WB的量还是能够提供的）。
6.细胞传代过多，导致蛋白质变异。使用传代次数少的细胞的表达的蛋白质进行对比，并且作为分子筛层析或HPLC的纯化标准。
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8楼2014-07-18 10:31:36
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
楼主的实验现象出现的问题涵盖了WB实验常出现的三种典型现象。
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9楼2014-07-18 10:32:33
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