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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » WB扫膜出现背景深且有些条带呈白亮状是怎么回事？
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herjasmine

新虫 (初入文坛)

[求助] WB扫膜出现背景深且有些条带呈白亮状是怎么回事？ 已有3人参与

之前做的一直很好。最近老是出现背景很深而有杂带的情况，膜上还有些条带白的发亮，也不知道是不是目标条带（杂带太多）。且换了抗体后还是会出现这样的问题，而实验室有其他老师做出来也是这样的情况（做的抗体和蛋白都不同）。大家认为可能是什么原因造成的呢？
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1楼 2014-03-28 20:32:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

WB出现非特异性条带的原因与解决方法：
1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度。
2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体。
3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。
4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量。
5.样品蛋白质发生了降解，降解产物成为了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是单克隆抗体时更为明显；避免对样品蛋白质反复冻融，食用新鲜的蛋白质样品，可以使用蛋白酶的广谱抑制剂（已经有商用产品），必要的话使用分子筛层析或HPLC纯化蛋白质样品后再上样（HPLC不能用于蛋白质制备，不过用做WB的量还是能够提供的）。
6.细胞传代过多，导致蛋白质变异。使用传代次数少的细胞的表达的蛋白质进行对比，并且作为分子筛层析或HPLC的纯化标准。
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8楼2014-07-18 10:31:36
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
图上来瞅瞅,白色条带可能是浓度太高底物都用完了,
也可能就是什么都没有,只是你曝光时间特别长
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2014-03-28 21:48:29
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d00614028

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然是整个实验室都是这种情况，可以从以下几个方面考虑：
1. 可能是封闭不够，是不是封闭液过期了，换换试试看看效果会不会好点。
2. 洗脱液有问题，重新配置TBST，看是不是PH值有问题，或者是没有加Tween。
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3楼2014-03-28 22:41:28
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herjasmine

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by d00614028 at 2014-03-28 22:41:28
既然是整个实验室都是这种情况，可以从以下几个方面考虑：
1. 可能是封闭不够，是不是封闭液过期了，换换试试看看效果会不会好点。
2. 洗脱液有问题，重新配置TBST，看是不是PH值有问题，或者是没有加Tween。

封闭液和洗脱液都重新配的。
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4楼2014-03-29 09:58:57
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