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WB扫膜出现背景深且有些条带呈白亮状是怎么回事？ 已有3人参与
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| 之前做的一直很好。最近老是出现背景很深而有杂带的情况，膜上还有些条带白的发亮，也不知道是不是目标条带（杂带太多）。且换了抗体后还是会出现这样的问题，而实验室有其他老师做出来也是这样的情况（做的抗体和蛋白都不同）。大家认为可能是什么原因造成的呢？ |
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2楼2014-03-28 21:48:29
d00614028
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3楼2014-03-28 22:41:28
4楼2014-03-29 09:58:57
5楼2014-03-29 10:25:18
凌波丽
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【答案】应助回帖
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WB背景高的可能原因与解决方法 1.洗膜不充分，增加洗涤液的体积和洗涤次数；在洗涤液中加入Tween=20。 2.二抗浓度过高，引起了一些非专一性的抗原-抗体相互作用，适当降低二抗浓度，可以分梯度进行。 3.二抗的识别抗原免疫簇不唯一，这是因为二抗是多克隆抗体，使用单克隆抗体的二抗，此时二抗的识别抗原免疫簇是唯一的，其非专一性的抗原-抗体相互作用会大为减少。当然，有时，单克隆抗体也会有识别抗原免疫簇不唯一，如果两种蛋白质的抗原免疫簇的结构很相近的话。如果不知道是不是二抗的识别抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情况下只加二抗实验，可以检测出是否为二抗的的抗原免疫簇的识别的原因，若是的话，可以先更换封闭试剂，若无效，则要同时更换二抗。 4.封闭不充分，增加封闭液的封闭时间，适当提高温度，更换封闭液。 5.曝光过度，缩短曝光时间。 6.检测过程中膜干燥，保持充分的反应液，避免膜干燥。 7．若无别的选择，可尝试选择5%的脱脂奶粉，同时加入Tween=20。 8.滴定一抗或二抗的效价，找到一个产生清晰的信号强度可以接受的较低的抗体浓度。 9.缩短一抗和二抗的孵育时间。 |
6楼2014-07-18 10:28:46
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7楼2014-07-18 10:29:13
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【答案】应助回帖
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WB出现非特异性条带的原因与解决方法： 1.抗体浓度过高；降低一抗、二抗的浓度。 2.一抗的特异性不足；使用单克隆抗体。 3.二抗的非特异性结合，不加一抗，其他操作不变，即可检测出二抗的非特异性的条带是否来自二抗的非特异性结合；此时需要重新选择二抗。 4.样品蛋白质上样量过大；降低上样量。 5.样品蛋白质发生了降解，降解产物成为了一抗或二抗的新的抗原，尤其是在一抗或二抗不是单克隆抗体时更为明显；避免对样品蛋白质反复冻融，食用新鲜的蛋白质样品，可以使用蛋白酶的广谱抑制剂（已经有商用产品），必要的话使用分子筛层析或HPLC纯化蛋白质样品后再上样（HPLC不能用于蛋白质制备，不过用做WB的量还是能够提供的）。 6.细胞传代过多，导致蛋白质变异。使用传代次数少的细胞的表达的蛋白质进行对比，并且作为分子筛层析或HPLC的纯化标准。 |
8楼2014-07-18 10:31:36
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9楼2014-07-18 10:32:33
