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IP后WB，蛋白比预期的大，正反拉蛋白都做了，都是大十几kD 已有4人参与
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最近在苦一个图，所以做了个ChIP，然后用我的目标蛋白（蛋白A）做WB，结果发现杂出来的带比蛋白A的理论大小大十几kD。 我们怀疑可能是非特异性条带的结合，于是尝试用蛋白A做CO-IP，然后用ChIP的抗体做WB，发现杂出来的带也比预计的大十几kD。 现在怀疑可能情况有一下几种： 1.发生了什么修饰 造成蛋白变大 2.结合了其他分子 但是由于WB是变性的 所以这一点上我们持有怀疑意见 3.非特异性结合 这一点上急需方法来排除，希望高手可以指教一下 我们实验室一直做RNA相关实验，最近才开始摸索Chromatin相关实验，小菜鸟满脸血跪求指教 OTZ |
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2楼2014-04-24 10:46:32
jurkat.1640
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用质谱测定一下蛋白质样品，很容易知道是否发生了共价修饰（相对分子量增加了），发生了则或者发生了细胞内的翻译后的修饰，或者是体外操作过程中发生了bioconjugation，不少的醛类化合物本身就会引起蛋白质交联，而不仅是引起蛋白质与DNA交联。 如果质谱相对分子量增加了相对的分子量增加，则改变有关的溶液环境，促使蛋白质溶解，比如加入表面活性剂，可以参考拆分蛋白质多聚体为单体的试验方法可以参考亲和层析的试验方法。 拆分蛋白质多聚体为单体的试验方法可以参考亲和层析的试验方法： （1）改变pH值或离子强度：比如可以使用NaCl梯度拆解，主要是用于静电作用引起的相互作用的蛋白质多聚体，改变pH值可以跟缓冲溶液的组成加入相应的酸或者碱； （2）如果蛋白质多聚体主要为疏水相互作用，而且改变pH值的结果不够有效，则需要用激烈的条件，比如加入聚乙二醇（最多到到60%，要分梯度加入）或二甲基亚砜（dimethylsulfoxide）（一般最多到到10%，要分梯度加入）以降低水溶液的极性 （3）可以考虑加入加入去垢剂(表面活性剂)，它们是具有亲水基又具有疏水基的物质，能够在低于临界胶束浓度（Citical Micelle Concentration ，简称：CMC）时有效结合于蛋白质的疏水区域，因此一般具有乳化、分散、和增溶作用，可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型，中性去垢剂在蛋白提取 钟应用的较多。 一般考虑使用的是：中性去垢剂或生物表面活性剂。 中性去垢剂 又称非离子表面活性剂，对蛋白质的变性作用影响较少，宜于蛋白质或酶提取之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类，如PEG200；多元醇类表面活性剂，如 山梨醇、司 盘类和吐温类；聚氧乙烯脂肪醇醚，如苄泽类、平平加类；聚氧乙烯烷基苯酚醚，如Igepal CO、乳化剂OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过Sephadex LH-50柱除去；也可直接上DEAE-Sephadex柱层析分离目的蛋白，不必先除去去垢剂。 也可以用天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂，包括种类较为广泛，如各种树胶（阿拉伯胶、杏胶、桃胶、果胶）、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆 酸类、多糖类（如环糊精）等。 具体用法可以参考有关试剂使用说明。浓度尽量低一些为好，浓度不能超过临界胶束浓度（Citical Micelle Concentration ，简称：CMC）。 临界胶束浓度cmc的含义如下： 在水中的表面活性剂低浓度时呈分子状态，并且三三两两地把亲油基团靠拢而分散在水中，当浓度逐渐增大一定程度时，许多表面活性剂分子立刻结合成大基团，形成“胶束”表面活性剂在水中形胶束所需的最低浓度称为临街胶束浓度，即CMC. 意义：CMC可作为表面活性剂表面活性的一种度量，CMC越小，表明这种活性剂形成胶束所需的浓度越低，达到表面饱和吸附的浓度越低。因而改变表面性质从 而起到润湿，乳化，增溶，起泡等作用所需的浓度也越低。此外，临界胶束浓度也是表面活性剂溶液性质发生显著变化的一个分水岭，CMC值对表面活性剂的研究 有着及其重要的参考价值的数据。 临界胶束浓度测定方法很多，用不同方法验证即可 （1）表面张力法 http://www.anatrace.com/tech_tips/TechBul_105.pdf （2）电导率法 方法＆原理http://151.fosu.edu.cn/hxsy/wuli ... daofajiaosu%20z.htm http://u.edu.cn/UpLoadFile/20080119080151.doc （3）紫外吸收分光光谱 http://www.ilib.cn/A-hxxb200624009.html （4）.芘荧光探针光谱法 http://www.ilib.cn/A-shjsyyy200701012.html 其中芘荧光探针光谱法可信度较高 （5）Citical Micelle Concentration by Conductance and Raman http://ed.augie.edu/~awaspaas/pchem/labs/cmc/cmc.html （4）也可以采用高浓度的（到3mol/L）的离子解离盐（比如KCN或KI）或中低浓 度的变性剂（低于4mol/L）的尿素或盐酸胍，都是分梯度加入。 总之，只要能拆解开多聚体即可，尽量少或不要变性，拆解后可用层析方法或者离心方法分离开多聚体和单体，分离开的多聚体再如前法循环操作分离到单体。 |
9楼2014-04-26 10:07:30
10楼2014-04-28 09:39:15
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