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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » IP后WB，蛋白比预期的大，正反拉蛋白都做了，都是大十几kD
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)

[求助] IP后WB，蛋白比预期的大，正反拉蛋白都做了，都是大十几kD 已有4人参与

最近在苦一个图，所以做了个ChIP，然后用我的目标蛋白（蛋白A）做WB，结果发现杂出来的带比蛋白A的理论大小大十几kD。
我们怀疑可能是非特异性条带的结合，于是尝试用蛋白A做CO-IP，然后用ChIP的抗体做WB，发现杂出来的带也比预计的大十几kD。

现在怀疑可能情况有一下几种：
1.发生了什么修饰 造成蛋白变大
2.结合了其他分子 但是由于WB是变性的 所以这一点上我们持有怀疑意见
3.非特异性结合 这一点上急需方法来排除，希望高手可以指教一下

我们实验室一直做RNA相关实验，最近才开始摸索Chromatin相关实验，小菜鸟满脸血跪求指教 OTZ
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1楼 2014-04-24 09:51:20
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逆天打酱油

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zxthhr7798 at 2014-04-24 12:21:50
chIP 是检验DNA和蛋白的结合，在做DNA定量前要降解蛋白，你的western是单独做的吗？应该和chip没有关系吧？ 糖集化修饰？ 如果怀疑是非特异性结合，你做个阴性对照不就清楚是不是阴性结合？

因为是想研究跟Chromotin complex结合的蛋白 所以ChIP拉下来复合体后WB检测
阴性对照没有带就可以说明问题了么？我的阴性对照是不加抗体，4度过夜，洗脱，然后样品做WB，结果是没有带的，这样具有说服力么？
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5楼2014-04-24 15:49:38
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HTKJ

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
2楼2014-04-24 10:46:32
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
逆天打酱油: 金币+5, ★有帮助 2014-04-25 14:12:47
做ChIP，蛋白质与核酸或其他蛋白交联，分子量大很正常。问题是你做CoIP，分子量大就不正常了。
有没有WB测过裂解液中的蛋白分子量多大？
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3楼2014-04-24 11:08:31
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zxthhr7798

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
逆天打酱油: 金币+5, ★有帮助 2014-04-25 14:13:03
chIP 是检验DNA和蛋白的结合，在做DNA定量前要降解蛋白，你的western是单独做的吗？应该和chip没有关系吧？ 糖集化修饰？ 如果怀疑是非特异性结合，你做个阴性对照不就清楚是不是阴性结合？
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4楼2014-04-24 12:21:50
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