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ljy241

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[交流] WB背景黑是什么原因？已有9人参与

我做一个分子量为180kd的蛋白wb，用7%的分离胶，60v转膜3h，5%milk封闭1h，一抗1：1000过夜（内参b-actin 1：1000），TBST 30minx5，二抗1：5000孵育1h，TBST 10x3，ECL显色，胶片曝光，内参很清楚，也很干净，但目的蛋白背景很黑，曝光之前肉眼都能看到整张膜都发亮，但条带还能看出来，请教各位是什么原因。

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1楼2014-07-17 10:06:27

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凌波丽

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youlinglyw: 金币+3 2014-07-18 12:55:07

WB背景高的可能原因与解决方法

1.洗膜不充分，增加洗涤液的体积和洗涤次数；在洗涤液中加入Tween=20。
2.二抗浓度过高，引起了一些非专一性的抗原-抗体相互作用，适当降低二抗浓度，可以分梯度进行。
3.二抗的识别抗原免疫簇不唯一，这是因为二抗是多克隆抗体，使用单克隆抗体的二抗，此时二抗的识别抗原免疫簇是唯一的，其非专一性的抗原-抗体相互作用会大为减少。当然，有时，单克隆抗体也会有识别抗原免疫簇不唯一，如果两种蛋白质的抗原免疫簇的结构很相近的话。如果不知道是不是二抗的识别抗原免疫簇不唯一，可以不加一抗的情况下只加二抗实验，可以检测出是否为二抗的的抗原免疫簇的识别的原因，若是的话，可以先更换封闭试剂，若无效，则要同时更换二抗。
4.封闭不充分，增加封闭液的封闭时间，适当提高温度，更换封闭液。
5.曝光过度，缩短曝光时间。
6.检测过程中膜干燥，保持充分的反应液，避免膜干燥。
7．若无别的选择，可尝试选择5%的脱脂奶粉，同时加入Tween=20。
8.滴定一抗或二抗的效价，找到一个产生清晰的信号强度可以接受的较低的抗体浓度。
9.缩短一抗和二抗的孵育时间。