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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » WB背景黑是什么原因？
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ljy241

新虫 (小有名气)

[交流] WB背景黑是什么原因？已有9人参与

我做一个分子量为180kd的蛋白wb，用7%的分离胶，60v转膜3h，5%milk封闭1h，一抗1：1000过夜（内参b-actin 1：1000），TBST 30minx5，二抗1：5000孵育1h，TBST 10x3，ECL显色，胶片曝光，内参很清楚，也很干净，但目的蛋白背景很黑，曝光之前肉眼都能看到整张膜都发亮，但条带还能看出来，请教各位是什么原因。
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1楼2014-07-17 10:06:27
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ljy241

新虫 (小有名气)
一抗有可能有点问题，但有时候做背景会低点。不知道是不是二抗浓度太高了，准备试下1：10000的
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3楼2014-07-17 11:20:52
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
youlinglyw: 金币+3 2014-07-18 12:54:56
背景黑可能有以下几个原因：
1. 没有封闭好，但这个可能很小

2. 一抗浓度太高，适当降低增加一抗稀释比例，你最好先做个titration，确定一个最佳的抗体稀释比例

3. 二抗孵育时间太长，一般室温45min，二抗切不可孵育时间太长
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2014-07-17 12:49:04
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ljy241

新虫 (小有名气)
我比较怀疑二抗，一抗的比例我以前做也没那么深的背景。这次试试二抗浓度降低，时间缩短
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5楼2014-07-17 12:53:31
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蓝晶石

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
二抗的问题吧，孵育时间短点，浓度降低一点，多洗一次试试看
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6楼2014-07-18 08:57:13
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