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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » NCBI上序列确定和引物设计上的问题
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linzshit

银虫 (小有名气)

[求助] NCBI上序列确定和引物设计上的问题 已有2人参与

小弟是做qpcr的，半路出家，以前一直是闷头做，也没太思考序列位置确定和引物设计问题，今天思考了一下，发现有好多问题折腾不清，特来宝地问问大神们，希望不吝赐教。
1. 针对于RNA样本进行PCR试验时，是不是我在构建模板的时候就用NCBI上查询的cDNA序列或者mRNA学列设计即可；
2. 针对于DNA样本进行PCR试验时，理论上要求我要在保守区域设计引物，那么保守区域的确定方式是不是就是当我针对于序列设计完引物，然后BLAST，没有相似度太高的同源序列即可；
3. 针对于模板构建，我想问的是如果精确定位目的基因位置的。譬如我想找的基因是PIK3CA的E542K也就是1624 G>A在exon 9上，这个1624是针对于那个定义说的，我能确定的是它肯定不是3号染色体整个序列上了，那么这个数字是针对于CDS说的还是mRNA说的，有文献上给出NG_012113.1，可是我在exon 9上说啥也找不到我想要的那个SNP；
4. 最后一个问题还是引物设计问题，我是针对于DNA设计的试验，所以肯定不会再mRNA上设计引物了，那么问题来了，我是在CDS上围绕这个SNP设计啊，还是在3号染色体全序列上围绕这个SNP设计。
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1楼 2015-06-01 16:26:04
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linzshit

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-06-01 16:54:17
楼主的qPCR是干嘛用的？听起来好复杂。能说明下吗？

荧光定量检测，主要用于检测疾病
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4楼2015-06-02 09:51:05
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主的qPCR是干嘛用的？听起来好复杂。能说明下吗？
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2楼2015-06-01 16:54:17
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xmcliulei

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
linzshit: 金币+20, ★★★很有帮助 2015-06-03 08:47:45
第一个问题：建议上下游引物夸至少一个内含子，若区分靶基因不同剪接转录本，则应在靶转录本特有序列处设计。另外还要查下靶基因是否存在假基因，设计的时候尽量避免假基因；
第二个问题：做DNA的qPCR直接设计一组特异性好的引物即可，个人感觉没有啥特殊位置要求。因为你特异性好的话已经满足你的要求了，没必要找保守区了对吧~
第三个问题：1624是指PIK3CA 9号外显子上第1624位的SNP，是由G变成A。你只要在UCSC上输入PIK3CA，他直接就给你在基因组里搜了，到时候你只要找到相应染色体上的位置就是了~
最后一个问题：你用gDNA作为研究对象，那当然在gDNA上设计引物啦~如果你要定量这个SNP，那你上游引物或者下游引物的3’端最好搭在这个SNP上，或者你用5‘端搭在这个SNP上面的Taqman Probe，如果你要克隆或者做sanger测序，那就随意多了。
以上仅供参考，希望能帮到你~
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3楼2015-06-02 00:18:07
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linzshit

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xmcliulei at 2015-06-02 00:18:07
第一个问题：建议上下游引物夸至少一个内含子，若区分靶基因不同剪接转录本，则应在靶转录本特有序列处设计。另外还要查下靶基因是否存在假基因，设计的时候尽量避免假基因；
第二个问题：做DNA的qPCR直接设计一组 ...

非常感谢，以前光顾着傻做了，基础知识差的一塌糊涂，现在正在恶补啊
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5楼2015-06-03 08:47:31
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