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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 学术帮助 » 质粒pcr为阳性，但酶切没有出现目的片段
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502015088_

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒pcr为阳性，但酶切没有出现目的片段

想请教一下各位虫友：

      我把我需要的两个基因连接到表达载体上（先连接的300bp大小的基因，测序正确后再连接的1885bp大小的基因），通过菌落PCR鉴定为阳性的菌落在进行质粒提取，后

进行质粒PCR为阳性。而对该质粒进行酶切，却没有出现目的条带（1885kb）。这是什么原因呢？

质粒pcr为阳性，但酶切没有出现目的片段
pKSV7-p43-REC质粒PCR.jpg


质粒pcr为阳性，但酶切没有出现目的片段-1
酶切
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1楼 2015-05-30 12:32:30
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502015088_

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by l1012003 at 2015-05-30 13:46:06
首先，确定你的目的基因真的连上去了，菌落pcr也有可能出现假阳性的结果，而且你还是两次加的基因，建议你单独用载体试一试！看能不能酶切成功！

虫友，你好！我说一下我的具体实验步骤，你帮我看一下疑问出现在哪里。

首先，我用EcoRI和BamHI酶切我的上游基因（300bp）和质粒骨架（P），连接后转化到大肠杆菌中，挑单菌落进行菌落PCR阳性后在提质粒(P1)进行质粒PCR，结果为阳性，送出去测序，测序结果正确。后再用BamHI和HindIII对质粒(P1)和我的下游基因（1885bp)进行酶切，连接后转化到大肠杆菌中，挑单菌落进行菌落PCR阳性后在提取质粒（P3），质粒PCR为阳性（图一）。后送出去测序说测序没有信号，测序用的是上游基因的上游引物和下游基因的下游引物。后对P3质粒进行酶切，没有下游基因（1885bp片段）。
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3楼2015-06-01 10:34:39
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l1012003

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
502015088_: 金币+2, 博学EPI+1, ★有帮助 2015-06-01 17:27:18
首先，确定你的目的基因真的连上去了，菌落pcr也有可能出现假阳性的结果，而且你还是两次加的基因，建议你单独用载体试一试！看能不能酶切成功！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2015-05-30 13:46:06
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