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502015088_

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒pcr为阳性,但酶切没有出现目的片段

想请教一下各位虫友:

      我把我需要的两个基因连接到表达载体上(先连接的300bp大小的基因,测序正确后再连接的1885bp大小的基因),通过菌落PCR鉴定为阳性的菌落在进行质粒提取,后

进行质粒PCR为阳性。而对该质粒进行酶切,却没有出现目的条带(1885kb)。这是什么原因呢?

质粒pcr为阳性,但酶切没有出现目的片段
pKSV7-p43-REC质粒PCR.jpg


质粒pcr为阳性,但酶切没有出现目的片段-1
酶切
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l1012003

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
502015088_: 金币+2, 博学EPI+1, 有帮助 2015-06-01 17:27:18
首先,确定你的目的基因真的连上去了,菌落pcr也有可能出现假阳性的结果,而且你还是两次加的基因,建议你单独用载体试一试!看能不能酶切成功!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2015-05-30 13:46:06
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502015088_

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by l1012003 at 2015-05-30 13:46:06
首先,确定你的目的基因真的连上去了,菌落pcr也有可能出现假阳性的结果,而且你还是两次加的基因,建议你单独用载体试一试!看能不能酶切成功!

虫友,你好!我说一下我的具体实验步骤,你帮我看一下疑问出现在哪里。

首先,我用EcoRI和BamHI酶切我的上游基因(300bp)和质粒骨架(P),连接后转化到大肠杆菌中,挑单菌落进行菌落PCR阳性后在提质粒(P1)进行质粒PCR,结果为阳性,送出去测序,测序结果正确。后再用BamHI和HindIII对质粒(P1)和我的下游基因(1885bp)进行酶切,连接后转化到大肠杆菌中,挑单菌落进行菌落PCR阳性后在提取质粒(P3),质粒PCR为阳性(图一)。后送出去测序说测序没有信号,测序用的是上游基因的上游引物和下游基因的下游引物。后对P3质粒进行酶切,没有下游基因(1885bp片段)。
3楼2015-06-01 10:34:39
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