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质粒pcr为阳性，但酶切没有出现目的片段
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想请教一下各位虫友： 我把我需要的两个基因连接到表达载体上（先连接的300bp大小的基因，测序正确后再连接的1885bp大小的基因），通过菌落PCR鉴定为阳性的菌落在进行质粒提取，后 进行质粒PCR为阳性。而对该质粒进行酶切，却没有出现目的条带（1885kb）。这是什么原因呢？  pKSV7-p43-REC质粒PCR.jpg  酶切 |
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2楼2015-05-30 13:46:06
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虫友，你好！我说一下我的具体实验步骤，你帮我看一下疑问出现在哪里。 首先，我用EcoRI和BamHI酶切我的上游基因（300bp）和质粒骨架（P），连接后转化到大肠杆菌中，挑单菌落进行菌落PCR阳性后在提质粒(P1)进行质粒PCR，结果为阳性，送出去测序，测序结果正确。后再用BamHI和HindIII对质粒(P1)和我的下游基因（1885bp)进行酶切，连接后转化到大肠杆菌中，挑单菌落进行菌落PCR阳性后在提取质粒（P3），质粒PCR为阳性（图一）。后送出去测序说测序没有信号，测序用的是上游基因的上游引物和下游基因的下游引物。后对P3质粒进行酶切，没有下游基因（1885bp片段）。 |
3楼2015-06-01 10:34:39