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PCR测序后产生的SNP是否是基因的真实存在的SNP？ 已有2人参与
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各位大神好 背景： 1. 正在扩增一个基因，有文献显示该基因在其他物种中为单一拷贝。 2. 正在研究的这个物种相关研究背景不多，材料的倍型目前不容易确定（但是可以确定所有材料）。 问题： 目前该基因的cDNA序列已经通过RACE拿到，基因组序列也通过根据cDNA序列设计的引物分别拿到全长并完成了拼接，并且在两端做了步移，也都得到了结果（在基因组序列拼接和步移的时候都有较长的overlap）。 但是根据结果来看cDNA序列与基因组序列之间SNP较多，基因组每次扩增结果建克隆测序克隆之间的SNP也比较多（约0.5~2%），使用的酶是takara的LA taq，目前由于无法确定这些SNP中哪些是PCR出的错误，哪些是测序的错误（峰图都还可以），哪些是真正的SNP。 5端步移结果显示出有两套不同的上游调控序列，但是都跟RACE结果不同（RACE结果只到ATG上游大概70bp左右，已经去掉RACE随机引物序列）。 所以请问，如何确定这些SNP是不是基因不同拷贝造成的？如何知道拷贝数并且知道相关基因序列呢？ 希望有经验的大虾不吝赐教。谢谢。 |
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2楼2015-05-25 14:19:31
luwei13566
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-28 08:31:27
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LZ你现在目的基因的cDNA和DNA全长序列都已经得到测序了，而且你无论是扩cDNA还是DNA所用的酶都是LA Taq？ 尽管其他文献里说该基因在其他物种是单拷贝，但是你还是得证明该基因是否是多拷贝，排除这个因素后基本可以定性是PCR的问题了。 1.多拷贝可用northern blot验证。 2.你用的这个酶我用过，说实话保真度并不高，如果你克隆的基因还比较长，而且扩增循环数过多的话可能性更大。 如果你的SNP在序列中间比较多，个人认为是PCR保真度不高所导致的，特别是你说克隆之间的测序结果都不一样，这说明你的PCR后期的循环已经出现了不少的突变，才导致后期涂板长出的单克隆测序结果都不一样，建议优化一下PCR的条件，或者选取高保真酶扩增之后再加A做TA克隆。 |
3楼2015-05-26 22:12:27
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7楼2015-05-28 10:27:30
luwei13566
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8楼2015-05-28 11:42:11
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