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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR测序后产生的SNP是否是基因的真实存在的SNP？
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corner_g

新虫 (初入文坛)

[交流] PCR测序后产生的SNP是否是基因的真实存在的SNP？ 已有2人参与

各位大神好

背景：

1. 正在扩增一个基因，有文献显示该基因在其他物种中为单一拷贝。

2. 正在研究的这个物种相关研究背景不多，材料的倍型目前不容易确定（但是可以确定所有材料）。

问题：

目前该基因的cDNA序列已经通过RACE拿到，基因组序列也通过根据cDNA序列设计的引物分别拿到全长并完成了拼接，并且在两端做了步移，也都得到了结果（在基因组序列拼接和步移的时候都有较长的overlap）。

但是根据结果来看cDNA序列与基因组序列之间SNP较多，基因组每次扩增结果建克隆测序克隆之间的SNP也比较多（约0.5~2%），使用的酶是takara的LA taq，目前由于无法确定这些SNP中哪些是PCR出的错误，哪些是测序的错误（峰图都还可以），哪些是真正的SNP。

5端步移结果显示出有两套不同的上游调控序列，但是都跟RACE结果不同（RACE结果只到ATG上游大概70bp左右，已经去掉RACE随机引物序列）。

所以请问，如何确定这些SNP是不是基因不同拷贝造成的？如何知道拷贝数并且知道相关基因序列呢？

希望有经验的大虾不吝赐教。谢谢。
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1楼 2015-05-25 10:02:43
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corner_g

新虫 (初入文坛)
秒沉体质。自顶。
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2楼2015-05-25 14:19:31
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2015-05-28 08:31:27
LZ你现在目的基因的cDNA和DNA全长序列都已经得到测序了，而且你无论是扩cDNA还是DNA所用的酶都是LA Taq？

尽管其他文献里说该基因在其他物种是单拷贝，但是你还是得证明该基因是否是多拷贝，排除这个因素后基本可以定性是PCR的问题了。
1.多拷贝可用northern blot验证。
2.你用的这个酶我用过，说实话保真度并不高，如果你克隆的基因还比较长，而且扩增循环数过多的话可能性更大。

如果你的SNP在序列中间比较多，个人认为是PCR保真度不高所导致的，特别是你说克隆之间的测序结果都不一样，这说明你的PCR后期的循环已经出现了不少的突变，才导致后期涂板长出的单克隆测序结果都不一样，建议优化一下PCR的条件，或者选取高保真酶扩增之后再加A做TA克隆。
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大家相互帮助哈
3楼2015-05-26 22:12:27
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小小逍遥人

金虫 (正式写手)

张斌猪
★
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你那边可以检测下SNP，对比下就可以知道了  或者你查下这个基因的snp
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生命还需要奇迹来衬托
4楼2015-05-27 12:47:39
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corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-26 22:12:27
LZ你现在目的基因的cDNA和DNA全长序列都已经得到测序了，而且你无论是扩cDNA还是DNA所用的酶都是LA Taq？

尽管其他文献里说该基因在其他物种是单拷贝，但是你还是得证明该基因是否是多拷贝，排除这个因素后基本可 ...

嗯，谢谢回复。

cDNA用的是试剂盒的SeqAmp，理论上来说肯定是保真的，但是RACE做的不是很理想，条带不是很好，所以转化效率很低，3端5端都是只有一两个克隆的，所以不能完全认为cDNA序列是对的。

酶的问题我也觉得比较对，已经着手订购高保真酶了。

至于多拷贝验证，倍性不清楚的情况下用norhtern可以检测么？或者您说的是southern？想过这些手段，主要觉得第一是没合适的内参。第二是也不能确定材料的倍性，就放弃了。
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5楼2015-05-28 07:43:33
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corner_g

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小小逍遥人 at 2015-05-27 12:47:39
你那边可以检测下SNP，对比下就可以知道了  或者你查下这个基因的snp

您说的SNP怎么检测呢？

谢谢回复
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6楼2015-05-28 07:44:42
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小小逍遥人

金虫 (正式写手)

张斌猪
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6楼: Originally posted by corner_g at 2015-05-28 07:44:42
您说的SNP怎么检测呢？

谢谢回复...

2楼说的对，SNP检测很简单   你知道基因，设计引物之后提取好DNA   之后pcr测序就好
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生命还需要奇迹来衬托
7楼2015-05-28 10:27:30
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luwei13566

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by corner_g at 2015-05-28 07:43:33
嗯，谢谢回复。

cDNA用的是试剂盒的SeqAmp，理论上来说肯定是保真的，但是RACE做的不是很理想，条带不是很好，所以转化效率很低，3端5端都是只有一两个克隆的，所以不能完全认为cDNA序列是对的。

酶的问题我 ...

嗯，更正一下，你这种情况确认拷贝得用southern。
1.至于内参，因为你的这个材料总基因组序列没有测，内参确实不好找，你说有文献显示该基因在其他物种中为单一拷贝，多看看别人确认单拷贝是怎么做的，他们用的内参你说不定你就可以用。
2.如果你做race出来的转化子只有几个，这几个转化子都测序了吗，之间是否有差异？
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大家相互帮助哈
8楼2015-05-28 11:42:11
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