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圣主魂

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩出来的片段短怎么办？ 已有5人参与

PCR扩出来的片段比学哥以前做的2100bp短（大约短200bp），引物稍微把内切酶改动了下，体系用过学哥的也是没扩出来。94°：5min;94°：30s，60°：30s；72°：3min;72°：10min；34个循环。一直在做这个悲催的PCR,,,,,求解脱.........
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1楼 2015-05-25 09:24:58
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erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
圣主魂: 金币+2, ★有帮助 2015-05-25 18:47:00
你把引物改了退火温度就要变了啊少年~不是有所有的引物都可以用一种退火温度的。退火温度就是你那个60℃的。
另外可能是你的引物特异性不强，建议延长引物。如果还是不行的话你就先割胶回收片段看看跑出来的到底是什么再说吧。
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2楼2015-05-25 12:30:20
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feng890327

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-26 23:04:33
以本人的经验来看，楼主的程序应该稍微优化一下，首先把整个序列的GC以及二级结构分析一下，确定退后温度，另外，楼主延伸的时间太长了，3min都可以扩七八千了，30s足够了，循环数在22-25个足够
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3楼2015-05-25 13:56:53
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喜欢听海

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
圣主魂: 金币+2, ★有帮助 2015-05-25 18:47:43
分析引物 改下退火温度 试试   还可以做个温度梯度
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4楼2015-05-25 14:00:13
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圣主魂

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 喜欢听海 at 2015-05-25 14:00:13
分析引物 改下退火温度 试试   还可以做个温度梯度

温度梯度做了没有P出来，引物是根据学哥以前用的 就是把内切酶换了~~
需要注意什么地方吗？
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5楼2015-05-25 18:35:53
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圣主魂

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by erland21411 at 2015-05-25 12:30:20
你把引物改了退火温度就要变了啊少年~不是有所有的引物都可以用一种退火温度的。退火温度就是你那个60℃的。
另外可能是你的引物特异性不强，建议延长引物。如果还是不行的话你就先割胶回收片段看看跑出来的到底是 ...

两种引物Tm值相差1°，本来打算回收测序看看的，后来老板不让，给生物公司做了 也是短....然后老板让我用学哥-80保存的菌液提质粒，用这个质粒PCR，就是一直扩不出来。一会我再分析下引物。谢谢
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6楼2015-05-25 18:41:21
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圣主魂

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by feng890327 at 2015-05-25 13:56:53
以本人的经验来看，楼主的程序应该稍微优化一下，首先把整个序列的GC以及二级结构分析一下，确定退后温度，另外，楼主延伸的时间太长了，3min都可以扩七八千了，30s足够了，循环数在22-25个足够

ORF的GC是61%，退火温度不是根据引物来确定嘛，设计的两个引物Tm全是61.7°，延长时间越长不是扩的越长嘛（我是这么认为的）可扩出来的还是短....循环数倒是没试过，一般都是34或者30。循环数对这个PCR影响大吗？谢谢
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7楼2015-05-25 18:46:37
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feng890327

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-05-26 11:23:49
引用回帖:
7楼: Originally posted by 圣主魂 at 2015-05-25 18:46:37
ORF的GC是61%，退火温度不是根据引物来确定嘛，设计的两个引物Tm全是61.7°，延长时间越长不是扩的越长嘛（我是这么认为的）可扩出来的还是短....循环数倒是没试过，一般都是34或者30。循环数对这个PCR影响大吗？谢 ...

1、退火温度不仅仅是看引物的tm值，整体的GC含量也很重要，楼主可以把温度稍微提高一点，包括变性的温度，
2、延伸时间越长确实扩的越长，但是楼主的基因只有2000bp左右，3min确实太长了
3、循环数越多越容易产生非特异性扩增
4、时间太长酶也失活了，其中可能有相当一段时间相当于空跑，浪费了很多时间，除非中途加酶，
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8楼2015-05-26 07:57:39
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paul_j

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同你上网因为楼主所说。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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9楼2015-05-26 09:07:16
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-05-26 11:23:53
PCR扩出来的片段比学哥以前做的2100bp短（大约短200bp）,这个片段基本上是对的，小200bp是正常的。

引物只换了内切酶的话，退火温度不用换，内切酶的碱基我基本是不计算进退火温度的，35个循环很好。延伸基本是一分钟1000bp，整体上你学哥的条件没问题。把你小200bp的片段送去测序看看，有条件的话，连个T载体，好测通。
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采菊东篱下，悠然见南山。
10楼2015-05-26 11:07:25
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