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圣主魂

新虫 (初入文坛)

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[求助] PCR扩出来的片段短怎么办？已有5人参与

PCR扩出来的片段比学哥以前做的2100bp短（大约短200bp），引物稍微把内切酶改动了下，体系用过学哥的也是没扩出来。94°：5min;94°：30s，60°：30s；72°：3min;72°：10min；34个循环。一直在做这个悲催的PCR,,,,,求解脱.........

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1楼2015-05-25 09:24:58

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圣主魂

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引用回帖:

3楼: Originally posted by feng890327 at 2015-05-25 13:56:53
以本人的经验来看，楼主的程序应该稍微优化一下，首先把整个序列的GC以及二级结构分析一下，确定退后温度，另外，楼主延伸的时间太长了，3min都可以扩七八千了，30s足够了，循环数在22-25个足够

ORF的GC是61%，退火温度不是根据引物来确定嘛，设计的两个引物Tm全是61.7°，延长时间越长不是扩的越长嘛（我是这么认为的）可扩出来的还是短....循环数倒是没试过，一般都是34或者30。循环数对这个PCR影响大吗？谢谢