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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩出来的片段短怎么办？
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圣主魂

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR扩出来的片段短怎么办？ 已有5人参与

PCR扩出来的片段比学哥以前做的2100bp短（大约短200bp），引物稍微把内切酶改动了下，体系用过学哥的也是没扩出来。94°：5min;94°：30s，60°：30s；72°：3min;72°：10min；34个循环。一直在做这个悲催的PCR,,,,,求解脱.........
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1楼 2015-05-25 09:24:58
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feng890327

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-26 23:04:33
以本人的经验来看，楼主的程序应该稍微优化一下，首先把整个序列的GC以及二级结构分析一下，确定退后温度，另外，楼主延伸的时间太长了，3min都可以扩七八千了，30s足够了，循环数在22-25个足够
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3楼2015-05-25 13:56:53
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erland21411

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
圣主魂: 金币+2, ★有帮助 2015-05-25 18:47:00
你把引物改了退火温度就要变了啊少年~不是有所有的引物都可以用一种退火温度的。退火温度就是你那个60℃的。
另外可能是你的引物特异性不强，建议延长引物。如果还是不行的话你就先割胶回收片段看看跑出来的到底是什么再说吧。
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2楼2015-05-25 12:30:20
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喜欢听海

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
圣主魂: 金币+2, ★有帮助 2015-05-25 18:47:43
分析引物 改下退火温度 试试   还可以做个温度梯度
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4楼2015-05-25 14:00:13
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圣主魂

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 喜欢听海 at 2015-05-25 14:00:13
分析引物 改下退火温度 试试   还可以做个温度梯度

温度梯度做了没有P出来，引物是根据学哥以前用的 就是把内切酶换了~~
需要注意什么地方吗？
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5楼2015-05-25 18:35:53
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