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圣主魂

新虫 (初入文坛)

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专业: 生物化学

[求助] PCR扩出来的片段短怎么办？已有5人参与

PCR扩出来的片段比学哥以前做的2100bp短（大约短200bp），引物稍微把内切酶改动了下，体系用过学哥的也是没扩出来。94°：5min;94°：30s，60°：30s；72°：3min;72°：10min；34个循环。一直在做这个悲催的PCR,,,,,求解脱.........

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1楼2015-05-25 09:24:58

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feng890327

新虫 (初入文坛)

应助: 10 (幼儿园)
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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2015-05-26 11:23:49

引用回帖:

7楼: Originally posted by 圣主魂 at 2015-05-25 18:46:37
ORF的GC是61%，退火温度不是根据引物来确定嘛，设计的两个引物Tm全是61.7°，延长时间越长不是扩的越长嘛（我是这么认为的）可扩出来的还是短....循环数倒是没试过，一般都是34或者30。循环数对这个PCR影响大吗？谢 ...

1、退火温度不仅仅是看引物的tm值，整体的GC含量也很重要，楼主可以把温度稍微提高一点，包括变性的温度，
2、延伸时间越长确实扩的越长，但是楼主的基因只有2000bp左右，3min确实太长了
3、循环数越多越容易产生非特异性扩增
4、时间太长酶也失活了，其中可能有相当一段时间相当于空跑，浪费了很多时间，除非中途加酶，