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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么我的PCR条带长度>目的片段长度
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merry2004120

银虫 (小有名气)

[求助] 为什么我的PCR条带长度>目的片段长度 已有8人参与

从组织中提取mRNA，RT后做普通PCR。目的基因大小是549bp，可是电泳条带位置像是在750左右。为什么？还有电泳条带为什么呈弯曲状？
Marker是2000的

为什么我的PCR条带长度>目的片段长度
j-温度-4-mc 2015-05-19 15 时 48 分.jpg
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1楼 2015-05-22 15:42:11
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fMssop

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
merry2004120: 金币+1 2015-05-23 22:13:46
提取的RNA中混有一定量的基因组DNA，这是不可避免的问题，RNA中或多或少都会有一定量的DNA存在，当你需要的那段基因表达特别低或者干脆不表达的时候，便会以DNA为模板而不是RNA了。所以，楼主可以上网查查，看看文献报道中的该基因RANsequence表达。至于跑成曲状，一般影响不大，看看胶的浓度，电压方面是否有问题。
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10楼2015-05-23 18:52:29
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普通回帖

木风弓玄

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物非特异性结合了吧，条带弯曲可能是胶没配好
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学海无涯
2楼2015-05-22 16:04:51
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
merry2004120: 金币+1, ★有帮助 2015-05-22 19:58:21
建议楼主回收测序看看
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3楼2015-05-22 16:14:42
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merry2004120

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 木风弓玄 at 2015-05-22 16:04:51
引物非特异性结合了吧，条带弯曲可能是胶没配好

胶没配好，指的是溶解不均匀吗？
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4楼2015-05-22 16:32:59
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-23 22:33:12
我觉得Marker弯曲主要是胶的问题或是事电压的问题，你把胶配好后再做一次看看条带是不是还在这个位置，先别急着否定。
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5楼2015-05-22 19:16:00
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merry2004120

银虫 (小有名气)
这个是之前一次P出的条带。同一块胶。做了两侧PCR，1楼的引物是这个的一般，所以非特异性扩增片段减少了很多，但是P出来的片段位置好像没变。这是不是说明引物有问题呀？
为什么我的PCR条带长度>目的片段长度-1
j-温度-3-mc 2015-05-15 15 时 48 分.jpg
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6楼2015-05-22 20:13:07
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merry2004120

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王冠傑 at 2015-05-22 19:16:00
我觉得Marker弯曲主要是胶的问题或是事电压的问题，你把胶配好后再做一次看看条带是不是还在这个位置，先别急着否定。

胶是1%的（0.3g琼脂糖+30ml TAE溶液），电压是120V。
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7楼2015-05-22 20:15:57
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a770992409

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
应该和你用的染料有关系，你做一个不加染料的胶，用泡染法染色看看有没有问题

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2015-05-23 01:37:18
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zeroon

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很可能是总dna没去处干净，以它为模板扩增了，得到的序列有内含子吧
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9楼2015-05-23 18:40:30
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