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merry2004120

银虫 (小有名气)

[求助] 为什么我的PCR条带长度>目的片段长度 已有8人参与

从组织中提取mRNA,RT后做普通PCR。目的基因大小是549bp,可是电泳条带位置像是在750左右。为什么?还有电泳条带为什么呈弯曲状?
Marker是2000的

为什么我的PCR条带长度>目的片段长度
j-温度-4-mc 2015-05-19 15 时 48 分.jpg
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fMssop

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
merry2004120: 金币+1 2015-05-23 22:13:46
提取的RNA中混有一定量的基因组DNA,这是不可避免的问题,RNA中或多或少都会有一定量的DNA存在,当你需要的那段基因表达特别低或者干脆不表达的时候,便会以DNA为模板而不是RNA了。所以,楼主可以上网查查,看看文献报道中的该基因RANsequence表达。至于跑成曲状,一般影响不大,看看胶的浓度,电压方面是否有问题。
10楼2015-05-23 18:52:29
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普通回帖

木风弓玄

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引物非特异性结合了吧,条带弯曲可能是胶没配好
学海无涯
2楼2015-05-22 16:04:51
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
merry2004120: 金币+1, 有帮助 2015-05-22 19:58:21
建议楼主回收测序看看
3楼2015-05-22 16:14:42
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merry2004120

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 木风弓玄 at 2015-05-22 16:04:51
引物非特异性结合了吧,条带弯曲可能是胶没配好

胶没配好,指的是溶解不均匀吗?
4楼2015-05-22 16:32:59
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王冠傑

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-23 22:33:12
我觉得Marker弯曲主要是胶的问题或是事电压的问题,你把胶配好后再做一次看看条带是不是还在这个位置,先别急着否定。
5楼2015-05-22 19:16:00
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merry2004120

银虫 (小有名气)

这个是之前一次P出的条带。同一块胶。做了两侧PCR,1楼的引物是这个的一般,所以非特异性扩增片段减少了很多,但是P出来的片段位置好像没变。这是不是说明引物有问题呀?
为什么我的PCR条带长度>目的片段长度-1
j-温度-3-mc 2015-05-15 15 时 48 分.jpg

6楼2015-05-22 20:13:07
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merry2004120

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 王冠傑 at 2015-05-22 19:16:00
我觉得Marker弯曲主要是胶的问题或是事电压的问题,你把胶配好后再做一次看看条带是不是还在这个位置,先别急着否定。

胶是1%的(0.3g琼脂糖+30ml TAE溶液),电压是120V。
7楼2015-05-22 20:15:57
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a770992409

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
应该和你用的染料有关系,你做一个不加染料的胶,用泡染法染色看看有没有问题

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2015-05-23 01:37:18
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zeroon

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
很可能是总dna没去处干净,以它为模板扩增了,得到的序列有内含子吧
9楼2015-05-23 18:40:30
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