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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助pcr扩增扩不出目的条带
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secretov

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 求助pcr扩增扩不出目的条带 已有4人参与

以黄鳝某性别基因设计了三对引物，想扩这个基因全长，前两对都跑出来了，而且我有三个DNA模板样本，说明DNA模板应该没问题。但是第三对怎么也阔不出来，也试过梯度PCR了从53°到61°都试过了，没有条带，请问各位大神我还要继续试温度么，怎么继续优化条件呢？

目的片段1082bp

我是用的25微升体系：ddH2O 15 微升 、  PCRmix 8微升、 引物分别0.5 微升、 DNA1微升

PRIMER6 上下游引物Tm值分别为：54.2° 和 54.6°

程序为:
95° 5min  、  94°1min 、55°1min 、72°1min 05s、72°10min 、4° forever

谢谢帮忙，才开始做PCR很多不懂
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  • 附件 1 : 2015-04-29_CYP__DNA.tif
    • 2015-04-30 17:14:09, 874.92 K

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1楼 2015-04-30 17:23:13
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yingheqian

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
RT-PCR吗？如果你确定RT的产物模板没有问题，按照你说的，应该不是温度问题，重新设计引物吧
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2楼2015-04-30 20:20:12
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secretov

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yingheqian at 2015-04-30 20:20:12
RT-PCR吗？如果你确定RT的产物模板没有问题，按照你说的，应该不是温度问题，重新设计引物吧

不是RT，是普通PCR。
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3楼2015-05-02 11:10:50
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neckey

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
优化pcr体系，参数，可能很耗时，这时候重新设计引物看看可能就能扩增出目的带。（我也是听另外一个吧友说的嘻嘻！）希望能帮你。
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4楼2015-05-02 11:56:18
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yan_nie

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-04 09:02:27
secretov: 金币+20, ★有帮助 2015-05-04 19:11:54
有可能是扩增的目标DNA区段的双链在扩增时没有完全打开（GC百分比比较高，导致目标区段DNA缠绕得较紧）。可以试一下加DMSO，用一下不同的百分比（比如2%，4%，8%）看看能不能扩增出目标条带。
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己欲立而立人，己欲达而达人。
5楼2015-05-04 00:09:03
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auwdh

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-04 09:02:32
pcr刚开始做会有很多问题的，你在这求助估计也没什么好的答案。他涉及到太多方面了，专业光讲pcr的书可不是几张纸，是几百页的书了。做多了就知道了，每一个步骤都可能有问题，模板啊，温度啊，浓度啊，强烈建议你看看分子克隆里面的相关章节。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我交出一片心，不怕你误解，谁没受过伤，谁没流过泪？
6楼2015-05-04 00:29:24
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梦源1989

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-05-04 09:02:35
其他两对引物扩出来了，基本可以排除dd水，模板的问题，感觉可以尝试换换mix，还有重新设计引物，和降低退火温度

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2015-05-04 01:17:52
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