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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA提取时，浓度4252.2，A260/280=1.99，但电泳跑不出RNA，原因是？
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依然自然

新虫 (小有名气)

[求助] RNA提取时，浓度4252.2，A260/280=1.99，但电泳跑不出RNA，原因是？ 已有10人参与

我在提取RNA时，取样0.1g，新鲜样品现磨，用的Trizol提取法。结果RNA的浓度可以，2.0>A260/280>1.8，A260/230>2.0。但跑胶时没有RNA出现，只有点样孔很亮，和DNA Marker条带（图1）。跑胶时采用点样体系：DNA Loading Buffer、DNA Marker、Gel stain（核酸染料）各2ul，上样量2ul。跑胶条件：U=100V、I 随意，时间12min。出现问题之后，我采用大电泳槽电泳，电泳条件为：U=220V、I 随意、时间15min。结果是RNA拖尾，DNA Marker更清楚（图2）。请问这种问题可能是由于什么原因造成的？谁有好主意接下来我该做些什么测试才能找出问题和解决问题？谢谢！

RNA提取时，浓度4252.2，A260/280=1.99，但电泳跑不出RNA，原因是？
图1.jpg


RNA提取时，浓度4252.2，A260/280=1.99，但电泳跑不出RNA，原因是？-1
图2.jpg
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生命就如旅行。。。。所以要一直笑着
1楼 2015-05-13 10:52:51
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by mataomatao at 2015-05-13 20:25:25
能够证明提取的是RNA？如果做核磁采个P谱还差不多；仅仅是紫外，有DNA等或者降解的RNA，蛋白，色素等污染跑胶不正常；是可以理解的

要是提个RNA都得做MRI，那做分子生物实验的同学们都要跪了。紫外分光光度计，电泳，RT-PCR个个都能证明提出来的是不是RNA。

楼主电泳没跑好啊，第一个图Marker都没跑开就不说了，第二个图Marker用的是啥？普通琼脂糖胶跑RNA，最好用DL2000 DNA Marker，胶用0.8~1.2%，28S rRNA跑的位置和2000bp差不多。

前面有人答说上样量太大，建议稀释，我觉得很有道理。4.5ug/uL啊，这浓度！一般用个300-400ng跑电泳就能看得比较清楚了。

另外就是试试CTAB法，或者买个植物总RNA提取试剂盒。
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20楼2015-05-19 10:41:35
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小蚂蚁虫

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
按照我们的说法就是没有提出来
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15楼2015-05-14 22:18:09
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普通回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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依然自然(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-05-15 19:33:49
加样孔很亮，应该是你的RNA中有杂蛋白污染。
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2楼2015-05-13 15:43:17
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依然自然

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-05-13 15:43:17
加样孔很亮，应该是你的RNA中有杂蛋白污染。

我提取的植物是一种多酚多糖的，听我师姐的意思是RNA被一种蛋白或者糖类包裹着，跑不出来，但她也不知道如何改进。请问如何有效的改进我的实验？  谢谢了！
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3楼2015-05-13 18:22:19
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
都没提出来，测OD有什么用

[ 发自小木虫客户端 ]
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4楼2015-05-13 18:28:00
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 依然自然 at 2015-05-13 18:22:19
我提取的植物是一种多酚多糖的，听我师姐的意思是RNA被一种蛋白或者糖类包裹着，跑不出来，但她也不知道如何改进。请问如何有效的改进我的实验？  谢谢了！...

试试氯化锂沉淀法，文献中也有很多改良氯化锂法提多酚多糖植物RNA的操作步骤，或是买专用于提取多酚多糖植物RNA的试剂盒。
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依然自然
5楼2015-05-13 19:25:12
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依然自然

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-05-13 18:28:00
都没提出来，测OD有什么用

初提，很多不懂，就按程序走了一遍   看看哪里会错，后面好加以注意。你说的没提出来，是看胶就能看出来的是不？我提的步骤：
1.取0.1g新鲜叶片，液氮研磨，加1ml Trizol于研钵中，待快溶解时再研磨，后将研磨液移至预冷离心管，加200ul氯仿，剧烈震荡15s，室温静置10min，13000r/min、4、15min。
2.移上清，加500ul预冷的异丙醇，剧烈震荡15s、4、静置10min。4、13000r/min、10min。
3.弃上清，加500ul 75%乙醇，上下震荡15s，4、13000r/min、15min。
4.弃上清，风干75%乙醇，加100ulDEPC-water 55 溶解5min.
5.加130ul 酸性酚，4、13000r/min、15min。
6.移上清至新离心管，加入等体积氯仿，4、13000r/min、15min。
7.移上清至新离心管，加1/10体积的NaAc、2倍体积的100%乙醇，4、13000r/min、15min。
8.弃上清，加500ul 75%乙醇，上下震荡15s，4、13000r/min、15min。
9.弃上清，风干75%乙醇，加10ulDEPC-water 55 溶解5min.
10.取2ul测浓度，2ul点样。
以上是我的实验过程，麻烦帮我看看哪里出错了？我提的是多酚多糖类植物的叶片RNA。  谢谢指点！
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6楼2015-05-13 19:42:35
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依然自然

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by stone2239 at 2015-05-13 19:25:12
试试氯化锂沉淀法，文献中也有很多改良氯化锂法提多酚多糖植物RNA的操作步骤，或是买专用于提取多酚多糖植物RNA的试剂盒。...

恩  谢谢指点哈，我去查查这方面的资料。
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7楼2015-05-13 19:49:46
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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依然自然(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-05-15 19:34:31
1.提取RNA的时候RNA的颜色有没有变深？
2.如果真是多糖多酚污染的话，听说有一种CTAB提植物RNA的方法，LZ可以去查一查。
3.其实可能最简便的解决方法就是把你现在提取样品稀释个100倍再跑个胶看看，你提的浓度那么大，随便混杂点多酚沉淀就把你点样孔给堵了，先先稀释了跑一下看看能不能跑出孔，如果实在是你RNA全给结合了话只有试一试专门的试剂盒了！~你的提取方法是没有问题的
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依然自然
大家相互帮助哈
8楼2015-05-13 20:20:20
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
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依然自然
9楼2015-05-13 20:25:25
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依然自然

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by luwei13566 at 2015-05-13 20:20:20
1.提取RNA的时候RNA的颜色有没有变深？
2.如果真是多糖多酚污染的话，听说有一种CTAB提植物RNA的方法，LZ可以去查一查。
3.其实可能最简便的解决方法就是把你现在提取样品稀释个100倍再跑个胶看看，你提的浓度那么 ...

1.提取的时候，直到最后一次的75%乙醇水洗都还能看到小块的乳白色的沉淀。
2.有在找有关CTAB提取的方法。
3.初提还不直到能稀释在跑胶、点样的，请问你说的稀释是冰上直接用DEPC水稀释，还是得加DEPC水再水浴溶解稀释？
谢谢指导了！
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10楼2015-05-14 09:46:05
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