| 查看: 1574 | 回复: 8 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
引物设计问题 已有2人参与
|
||
|
请教一下各位师兄师姐，我要扩增一段基因，在gene bank里查询到mRNA长度为3590bp，CDS从61到3028bp，我需要设计一对特异性引物包含该基因所有片段，那么，我设计的时候是不是只能从61bp和3028bp处开始寻找较好的引物呢？这样的话引物几乎固定了，选择的范围就很小了，只能是增加减少碱基的区别，设计出来的引物很多found，怎么办呢？ 如果从CDS序列中间寻找较好的引物，只能扩出其中的一部分，我需要做该基因的克隆、原核表达及免疫效果，只用其中一部分是不是没有说服力，必须扩增出全部呢？ 另外在5‘端设计酶切位点时，用不用考虑对引物TM值的影响呢？加入酶切位点以后，5’端还需要保护碱基吗（酶切位点分别是BamHI、EcoRI） 刚进实验室的小白，请各位大神不吝赐教，小妹一定虚心接受批评建议。跪谢。 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有187人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 引物设计保护性碱基问题
已经有6人回复
- 求助引物设计和载体构建问题
已经有6人回复
- 求助检测基因沉默的qPCR引物设计问题
已经有7人回复
- 关于简并引物设计问题
已经有5人回复
- 求助怎么设计这样的引物
已经有19人回复
- 求助引物设计：前前后后三次都有问题，请大神帮帮忙…………感激不尽
已经有28人回复
- 请问设计引物前为什么要进行同源性比较？？
已经有15人回复
- 引物设计——下游引物是否需要考虑阅读框问题
已经有6人回复
- real-time引物设计问题，关于保守取，内含子
已经有10人回复
- 求助设计引物时酶切位点保护碱基的问题
已经有19人回复
- 做原核表达引物设计的有关问题
已经有14人回复
- 关于pcr引物设计的问题
已经有6人回复
- 引物设计区域选择问题
已经有7人回复
- RACE的引物设计问题
已经有7人回复
- 网站引物设计出错
已经有3人回复
- 点突变引物设计的问题
已经有11人回复
- 引物设计的问题
已经有13人回复
- 设计引物的时候，△G的高低代表了什么啊？请大家指教，谢谢
已经有3人回复
- 引物设计的问题
已经有6人回复
- 【求助/交流】引物设计的 序列选择问题
已经有9人回复
6楼2015-05-08 19:09:56
2楼2015-05-07 19:38:04
3楼2015-05-08 11:47:14
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-08 22:24:28
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-08 22:24:28
|
1.cDNA是包含5‘UTR区和3'UTR区的。 2.直接在61和3028处设计引物的话，可能找不到合适的引物，就像你说的有很多fund，这样会影响扩增效率；另外，这一步PCR时用的模板是cDNA，是各种cDNA的混合物，模板复杂，易错配，也会影响扩增结果。综上，这样直接设计引物扩经常会出现扩不出或扩出非目标带的问题，导致实验无法继续。先设计特异性好、扩增效率高的引物把序列得到，连到载体上，以载体为模板，再以61和3028处的引物去扩，这样因为模板是单一的，即使引物不是很合适，仍能得到高效扩增。 3.3000是长，但也不是不能扩，所以更要按我说的方法扩。有全长就不用做RACE了，或者你可以用重叠PCR试试，把你的3000多序列分两次扩，然后再扩全长。 |
4楼2015-05-08 13:09:14
