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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物设计问题
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Cindycclove

新虫 (小有名气)

[求助] 引物设计问题 已有2人参与

请教一下各位师兄师姐，我要扩增一段基因，在gene bank里查询到mRNA长度为3590bp，CDS从61到3028bp，我需要设计一对特异性引物包含该基因所有片段，那么，我设计的时候是不是只能从61bp和3028bp处开始寻找较好的引物呢？这样的话引物几乎固定了，选择的范围就很小了，只能是增加减少碱基的区别，设计出来的引物很多found，怎么办呢？
如果从CDS序列中间寻找较好的引物，只能扩出其中的一部分，我需要做该基因的克隆、原核表达及免疫效果，只用其中一部分是不是没有说服力，必须扩增出全部呢？
另外在5‘端设计酶切位点时，用不用考虑对引物TM值的影响呢？加入酶切位点以后，5’端还需要保护碱基吗（酶切位点分别是BamHI、EcoRI）

刚进实验室的小白，请各位大神不吝赐教，小妹一定虚心接受批评建议。跪谢。
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1楼 2015-05-07 14:52:30
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-05-07 22:05:51
1.最好扩完整编码区。
2.可在61前和3028后设计引物，先扩出来包含完整编码框的片段连到克隆载体上，然后以载体为模板，再设计加酶切位点的引物扩从起始密码子到终止密码子的编码区。
3.加酶切位点引物计算Tm时不需考虑增加的酶切位点及保护碱基序列。
4.如果是要直接酶切PCR产物，要加保护碱基；如果含酶切位点的PCR产物连T载后酶切，则可以不加保护碱基。
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2楼2015-05-07 19:38:04
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Cindycclove

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2015-05-07 19:38:04
1.最好扩完整编码区。
2.可在61前和3028后设计引物，先扩出来包含完整编码框的片段连到克隆载体上，然后以载体为模板，再设计加酶切位点的引物扩从起始密码子到终止密码子的编码区。
3.加酶切位点引物计算Tm时不需 ...

我是这样理解的，mRNA反转录为cDNA，cDNA不包含非编码区啊，我用cDNA作为模板，如果引物设计在非编码区上，应该无法配对吧（我的意思是引物应该从61和3028为起点，而不是前后）
先扩全部片段，连接载体，再以载体为模板设计酶切位点扩的作用是什么呢
另外导师说3000左右的片段比较长，很难扩诶。除了RACE，普通pcr可以扩吗
再麻烦您给我解答一下哈~~
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3楼2015-05-08 11:47:14
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-08 22:24:28
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3楼: Originally posted by Cindycclove at 2015-05-08 11:47:14
我是这样理解的，mRNA反转录为cDNA，cDNA不包含非编码区啊，我用cDNA作为模板，如果引物设计在非编码区上，应该无法配对吧（我的意思是引物应该从61和3028为起点，而不是前后）
先扩全部片段，连接载体，再以载体 ...

1.cDNA是包含5‘UTR区和3'UTR区的。
2.直接在61和3028处设计引物的话，可能找不到合适的引物，就像你说的有很多fund，这样会影响扩增效率；另外，这一步PCR时用的模板是cDNA，是各种cDNA的混合物，模板复杂，易错配，也会影响扩增结果。综上，这样直接设计引物扩经常会出现扩不出或扩出非目标带的问题，导致实验无法继续。先设计特异性好、扩增效率高的引物把序列得到，连到载体上，以载体为模板，再以61和3028处的引物去扩，这样因为模板是单一的，即使引物不是很合适，仍能得到高效扩增。
3.3000是长，但也不是不能扩，所以更要按我说的方法扩。有全长就不用做RACE了，或者你可以用重叠PCR试试，把你的3000多序列分两次扩，然后再扩全长。
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4楼2015-05-08 13:09:14
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Cindycclove

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by stone2239 at 2015-05-08 13:09:14
1.cDNA是包含5‘UTR区和3'UTR区的。
2.直接在61和3028处设计引物的话，可能找不到合适的引物，就像你说的有很多fund，这样会影响扩增效率；另外，这一步PCR时用的模板是cDNA，是各种cDNA的混合物，模板复杂，易错 ...

要做免疫效力的研究，导师说可以根据别人的文献（因为这个基因没人研究貌似）推测一下他可能起保护效力的区域，只扩这一区域。我查了一些文献，打算用DNAstar分析试试，不知道从理论上讲可行么。。
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5楼2015-05-08 17:59:14
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Cindycclove at 2015-05-08 17:59:14
要做免疫效力的研究，导师说可以根据别人的文献（因为这个基因没人研究貌似）推测一下他可能起保护效力的区域，只扩这一区域。我查了一些文献，打算用DNAstar分析试试，不知道从理论上讲可行么。。...

免疫效力我不懂，你还是听导师的参考文献或请教下别人。
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6楼2015-05-08 19:09:56
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
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7楼2015-05-09 09:15:15
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mataomatao

禁虫 (正式写手)
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8楼2015-05-09 09:17:08
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mataomatao at 2015-05-09 09:15:15
BamHI、EcoRI....这个看清楚；保护碱基一定要的...

这两个有什么特别的吗？你没有看明白我的建议，直接酶切PCR产物时是必须加保护碱基，但是如果要把PCR产物连到T-simple载体上再切就不需要加保护碱基。
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9楼2015-05-09 13:00:55
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