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风来风去com

铜虫 (初入文坛)

[求助] 引物设计保护性碱基问题 已有4人参与

我需要在目的基因两端设计引物,但是引物前面的GC含量太低,后面的GC含量太高,上游引物的酶切位点想用BamH1或者Nde1,下游引物的酶切位点用Xho1,加上在网上查到的保护性碱基还是上游引物GC太低,下游引物GC含量太高,想问一下保护性碱基可以随便加吗?BamH1和Nde1 ,Xho1还可以加哪些保护性碱基?谢谢了
在是在网上查到的保护性碱基
Nde1           CATATG
                CCATATG
              CCCATATG
            CGCCATATG     
      GGGTTTCATATG
    GGAATTCCATATG
  GGGAATTCCATATG

Bamh1        GGATCC
                CGGATCC
              CGGGATCC   
            CGCGGATCC   

Xho1……….CTCGAGG
                 CTCGAGGG
                CTCGAGCGG
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xfxycy3090

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引物的参数什么的,不要太当真,迫不得已的时候随便设计引物优化PCR试一试,简并引物还不是可以扩出来。
2楼2014-11-13 13:02:48
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风来风去com

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xfxycy3090 at 2014-11-13 13:02:48
引物的参数什么的,不要太当真,迫不得已的时候随便设计引物优化PCR试一试,简并引物还不是可以扩出来。

Nde1  CGCCATATGatgatgaaagtattaattgttgaaagcg
长度37  TM  69.2  GC% 35.1
Bamh1   CGCGGATCCatgatgaaagtattaattgttg
长度31  TM  64.9  GC% 38.7
下游引物Xho1   GCTCGAGTTACGCTTTCACGCACATAACGT
长度30  TM  74  GC% 50
我不会上图
需要基因序列吗?
3楼2014-11-13 14:07:17
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

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至少我们实验室保护碱基是随便加的,别搞出发夹结构之类的就好~一般都是加4个左右平衡一下引物的GC比
4楼2014-11-13 14:18:40
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意萧02

木虫 (正式写手)

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随便加,保持GC和AT大概相等就可以了。
5楼2014-11-13 18:48:08
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意萧02

木虫 (正式写手)

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引用回帖:
5楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-13 18:48:08
随便加,保持GC和AT大概相等就可以了。

不过最好和两端的连接端的碱基能配对
6楼2014-11-13 18:49:58
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

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保护碱基随便加,2个就行,即使不加也可以。至于保护碱基对GC含量的影响半点关系都没有。
7楼2014-11-13 20:02:02
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