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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请大神帮忙分析引物设计的是否合理？
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] 请大神帮忙分析引物设计的是否合理？ 已有4人参与

序列：
ATGGATGCTGATGCAGCTCTAGACCGGTGTGGAAAAGAGTTCAAAGTGGACATTTCCAGG
ATCAGCAGTTGTGCTGCCAGTGAGCACGGATCTGCTCTGCTGAAGAAACATGGAGACGAC
ACACACATCATAGAGCCCGGTTTCATTCCAACTATTATAGTAAATAATTCCAAAGACAAT
CAACCAGCTTTACTCAAAAACTTCCTCCTAGAAGTATATGACATAACAAATTGTGAGAAC
GGCGTGTTCAAGGACGACCAGAAGCTCAAGTGCTACATGTTCTGTCTGCTAGAGGAGGCC
AGTGTTGCTGATGAGAACGGCGTAGTAGACTACGAAATGATGATCAGCTTGATACCCGAG
GACTATACAGAAAGAGTTTCAAAAATGATAATGGCCTGCAAACATCTAGATACACCAGAT
AAGGATAAATGCCAAAGGGCGTTCGATGTTCATAAGTGTTCTTATGAAAAGGATCCAGAC
ATACTTACTGAGTACTAA
扩全长
F'ATGGATGCTGATGCAGC
R'GTACTCAGTAAGTATGTCTGGATCCTTT
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踏实
1楼 2014-11-10 17:02:10
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

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【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:03
引用回帖:
5楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-11 18:58:17
退火温度52度左右，做了梯度48-60，均没有目的条带，也做了touch down...

引物设计是没问题的，可以适当延长一下引物长度，提高一下Tm值，一般Tm值在60左右比较好
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
6楼2014-11-11 20:43:23
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wangranjun

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广庭之惘然

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:07
似乎是可行的，具体可以看一下Tm值。你没有设计酶切位点？
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
2楼2014-11-11 17:16:49
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 17:16:49
似乎是可行的，具体可以看一下Tm值。你没有设计酶切位点？

首先，十分感动你帮我分析，有酶切位点，保护碱基，并且特异性对比，也没有问题，但是pcr就是没有目的片段，只有弱弱的引物二聚体，用的ex-taq酶，求指点
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踏实
3楼2014-11-11 18:17:29
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wangranjun

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【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:11
引用回帖:
3楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-11 18:17:29
首先，十分感动你帮我分析，有酶切位点，保护碱基，并且特异性对比，也没有问题，但是pcr就是没有目的片段，只有弱弱的引物二聚体，用的ex-taq酶，求指点...

那应该是复性温度不合适，一般我们选择Tm值低5℃作为复性温度……温度不合适就会有二聚体的，你可以试一个温度梯度
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
4楼2014-11-11 18:44:25
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 18:44:25
那应该是复性温度不合适，一般我们选择Tm值低5℃作为复性温度……温度不合适就会有二聚体的，你可以试一个温度梯度...

退火温度52度左右，做了梯度48-60，均没有目的条带，也做了touch down
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踏实
5楼2014-11-11 18:58:17
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 20:43:23
引物设计是没问题的，可以适当延长一下引物长度，提高一下Tm值，一般Tm值在60左右比较好...

加上酶切位点，保护碱基，退火温度就62了，不知它们算不算有效片段

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踏实
7楼2014-11-12 00:05:04
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Pschanhui

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:15
我在扩全长的时候的引物tm不算酶切位点个保护碱基

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8楼2014-11-12 01:42:14
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:19
没看懂这个引物设计，酶切位点加在3端？这个是想扩出来干嘛的？

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9楼2014-11-12 07:47:31
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Pschanhui at 2014-11-12 01:42:14
我在扩全长的时候的引物tm不算酶切位点个保护碱基

我记得之前看过说酶切位点加保护碱基不属于有效Tm值，可是，酶切位点和保护碱基也是你pcr出来的，不解？可否解释一下
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踏实
10楼2014-11-12 09:03:19
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