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hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] 请大神帮忙分析引物设计的是否合理? 已有4人参与

序列:
ATGGATGCTGATGCAGCTCTAGACCGGTGTGGAAAAGAGTTCAAAGTGGACATTTCCAGG
ATCAGCAGTTGTGCTGCCAGTGAGCACGGATCTGCTCTGCTGAAGAAACATGGAGACGAC
ACACACATCATAGAGCCCGGTTTCATTCCAACTATTATAGTAAATAATTCCAAAGACAAT
CAACCAGCTTTACTCAAAAACTTCCTCCTAGAAGTATATGACATAACAAATTGTGAGAAC
GGCGTGTTCAAGGACGACCAGAAGCTCAAGTGCTACATGTTCTGTCTGCTAGAGGAGGCC
AGTGTTGCTGATGAGAACGGCGTAGTAGACTACGAAATGATGATCAGCTTGATACCCGAG
GACTATACAGAAAGAGTTTCAAAAATGATAATGGCCTGCAAACATCTAGATACACCAGAT
AAGGATAAATGCCAAAGGGCGTTCGATGTTCATAAGTGTTCTTATGAAAAGGATCCAGAC
ATACTTACTGAGTACTAA
扩全长
F'ATGGATGCTGATGCAGC
R'GTACTCAGTAAGTATGTCTGGATCCTTT
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踏实
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wangranjun

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广庭之惘然

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【答案】应助回帖


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:03
引用回帖:
5楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-11 18:58:17
退火温度52度左右,做了梯度48-60,均没有目的条带,也做了touch down...

引物设计是没问题的,可以适当延长一下引物长度,提高一下Tm值,一般Tm值在60左右比较好
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
6楼2014-11-11 20:43:23
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普通回帖

wangranjun

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广庭之惘然

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:07
似乎是可行的,具体可以看一下Tm值。你没有设计酶切位点?
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
2楼2014-11-11 17:16:49
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 17:16:49
似乎是可行的,具体可以看一下Tm值。你没有设计酶切位点?

首先,十分感动你帮我分析,有酶切位点,保护碱基,并且特异性对比,也没有问题,但是pcr就是没有目的片段,只有弱弱的引物二聚体,用的ex-taq酶,求指点
踏实
3楼2014-11-11 18:17:29
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wangranjun

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广庭之惘然

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【答案】应助回帖


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:11
引用回帖:
3楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-11 18:17:29
首先,十分感动你帮我分析,有酶切位点,保护碱基,并且特异性对比,也没有问题,但是pcr就是没有目的片段,只有弱弱的引物二聚体,用的ex-taq酶,求指点...

那应该是复性温度不合适,一般我们选择Tm值低5℃作为复性温度……温度不合适就会有二聚体的,你可以试一个温度梯度
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
4楼2014-11-11 18:44:25
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 18:44:25
那应该是复性温度不合适,一般我们选择Tm值低5℃作为复性温度……温度不合适就会有二聚体的,你可以试一个温度梯度...

退火温度52度左右,做了梯度48-60,均没有目的条带,也做了touch down
踏实
5楼2014-11-11 18:58:17
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wangranjun at 2014-11-11 20:43:23
引物设计是没问题的,可以适当延长一下引物长度,提高一下Tm值,一般Tm值在60左右比较好...

加上酶切位点,保护碱基,退火温度就62了,不知它们算不算有效片段

[ 发自小木虫客户端 ]
踏实
7楼2014-11-12 00:05:04
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Pschanhui

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:15
我在扩全长的时候的引物tm不算酶切位点个保护碱基

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-11-12 01:42:14
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意萧02

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-11-12 11:22:19
没看懂这个引物设计,酶切位点加在3端?这个是想扩出来干嘛的?

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-11-12 07:47:31
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Pschanhui at 2014-11-12 01:42:14
我在扩全长的时候的引物tm不算酶切位点个保护碱基

我记得之前看过说酶切位点加保护碱基不属于有效Tm值,可是,酶切位点和保护碱基也是你pcr出来的,不解?可否解释一下
踏实
10楼2014-11-12 09:03:19
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