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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 请大神帮忙分析引物设计的是否合理？
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 意萧02 at 2014-11-12 07:47:31
没看懂这个引物设计，酶切位点加在3端？这个是想扩出来干嘛的？

简单的克隆而已
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踏实
11楼2014-11-12 09:03:32
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zkz38210098

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
上下游引物长度相差太大了，适当延长上游引物的长度，还有下游引物的GC含量太低了，可以通过增加保护性碱基（G或C）来提高下游引物的GC含量，使它跟上游引物的GC含量相近且在40-60%之间。保护性碱基我们一般加到4-6个，确保后续双酶切能够酶切完全。
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12楼2014-11-12 10:38:36
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Pschanhui

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by hajierlove at 2014-11-12 09:03:19
我记得之前看过说酶切位点加保护碱基不属于有效Tm值，可是，酶切位点和保护碱基也是你pcr出来的，不解？可否解释一下...

在前2个循环中，没有与酶切位点和保护碱基相配对的碱基，如果你算tm时加上了酶切位点，会导致tm较高，如果参考这个高的tm值做pcr，pcr效果不好。个人观点

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13楼2014-11-12 12:34:49
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hajierlove

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zkz38210098 at 2014-11-12 10:38:36
上下游引物长度相差太大了，适当延长上游引物的长度，还有下游引物的GC含量太低了，可以通过增加保护性碱基（G或C）来提高下游引物的GC含量，使它跟上游引物的GC含量相近且在40-60%之间。保护性碱基我们一般加到4-6 ...

这样Tm值才相近，均加了酶切位点，保护碱基

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踏实
14楼2014-11-12 12:54:52
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