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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求大神帮忙设计引物，急急急！！！
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北化方华

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求大神帮忙设计引物，急急急！！！ 已有7人参与

请大神帮忙看看这两对引物有问题吗？P了一个多月都P不出来。
A基因
CGG    GGTACC(kpn1)    ATGAACGACCAAACGCAATTTACA
CCG    CTCGAG（xho1）TTAATCTAGGTCATCATCAATTTCC
b基因
CCGC  AGTACT（sac1）  ATGACCACCACTGCCCAAGAC
CCG    CTCGAG（xho1） TCAAACCTTTGCGCCGGTGTAA
没加酶切位点时能P出来，加了后就P不出来了，不知道原因出在哪里。
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1楼 2014-09-04 10:38:35
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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北化方华(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:30:35
给你一个办法：
先用不加酶切位点的引物扩增，连接到克隆载体（类似于T载体），再以菌液或者质粒为模板，用加酶切位点的引物扩增，这样即使引物有一点不匹配，也可以拉出产物的。
个人见解，可以试试
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没有做不到，只有想不到！
8楼2014-09-04 17:02:07
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lqx2006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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北化方华(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-10 09:20:23
设计引物最重要的是没错误引发，两条引物的tm不超过5，如果引物特异性高，酶切位点影响就不怎么大了，当然，如果你的序列没什么保密性，可以内信我，我帮你从新设计

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-09-05 09:09:16
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普通回帖

zero19871029

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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北化方华(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:30:15
这个不一定是引物的问题，加了酶切位点跟保护碱基后可以试试改一下退火温度什么的，个人认为目的基因上21个碱基还是稍短，可以增加下引物的长度试试
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2楼2014-09-04 10:43:49
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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北化方华(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-04 19:30:24
A组看不出什么问题；
B组引物在加酶切位点后，F出现45℃颈环结构，R的颈环结构Tm增加到35℃，但是应该不影响PCR。
可能加酶切位点后出现非特异性结合，比靶位点的结合还稳固
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3楼2014-09-04 10:58:21
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zero19871029 at 2014-09-04 10:43:49
这个不一定是引物的问题，加了酶切位点跟保护碱基后可以试试改一下退火温度什么的，个人认为目的基因上21个碱基还是稍短，可以增加下引物的长度试试

现在不算酶切位点的引物tm值就有66度了，再延长会不会太高了呢？
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4楼2014-09-04 13:29:17
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北化方华

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jurkat.1640 at 2014-09-04 10:58:21
A组看不出什么问题；
B组引物在加酶切位点后，F出现45℃颈环结构，R的颈环结构Tm增加到35℃，但是应该不影响PCR。
可能加酶切位点后出现非特异性结合，比靶位点的结合还稳固

现在的问题是两组非特异性结合都很多，但是再延长引物的话tm值就超70度了。
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5楼2014-09-04 13:30:27
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zero19871029

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-09-04 13:29:17
现在不算酶切位点的引物tm值就有66度了，再延长会不会太高了呢？...

一般退火温度选择低于TM值5-10度的
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6楼2014-09-04 13:57:26
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★ ★
北化方华(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 09:20:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by 北化方华 at 2014-09-04 13:30:27
现在的问题是两组非特异性结合都很多，但是再延长引物的话tm值就超70度了。...

1. 可以先用普通PCR扩增基因，再用带酶切位点的引物扩增。
2. 看看mRNA序列，看能不能在CDS的外围扩增，有时候外围有天然的酶切位点或者近似酶切位点，这样可以减少引物的不匹配碱基。
没办法就用Tm 70。
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7楼2014-09-04 14:19:26
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你是什么体系扩增？我以前用15ulP不出来，换25ul体系就批出来了。可以换一下体系。
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求是
9楼2014-09-05 09:00:05
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