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引物设计实例分析 已有1人参与
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发现一个很好的引物设计的PPT，传上来跟大家分析一下，同时我有几个点没看懂，也想请明白的朋友给指点一下。 目的： 将plasmid 2上GFP基因扩下来连到plasmid 1 上 GFP基因 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3’ 问题一： Primer1: 5’ ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC………….. Primer2: 5’ Sample TextTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA……. 引物2 TTA为什么去掉？不需要终止密码子吗？ 问题二加酶切位点后： Primer1: 5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 添加酶切位点后为什么在primer1的酶切位点后面加个 T 呢？是为了三个一组ATG刚好一组吗？为什么加的是T不是别的？ Primer2: 5’gg atc cctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC为何在primer2的酶切位点后加CT？这有何讲究？ 问题叙述的也许不清楚，请大侠 参看PPT给解释一下吧。谢谢 |
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本内容由用户自主发布，如果其内容涉及到知识产权问题，其责任在于用户本人，如对版权有异议，请联系邮箱：xiaomuchong@tal.com - 附件 1 : 引物设计实例分析.ppt
2014-01-03 15:21:18, 215 K
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cicelyzh
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1. TAA是终止密码子，去掉的原因可能是要在基因后面融合表达标签或者其他基因。用后面基因的终止密码子就可以了。 2. 在酶切位点与ATG之间加碱基一般是考虑移码的问题。情况大概是由于在这个基因前面有其他基因或者标签需要融合表达。在基因的反向引物的酶切位点之后加碱基也是考虑移码是问题，大概基因后面有表达标签或者融合蛋白。具体是什么碱基问题不是很大。主要考虑不能形成终止密码子。我想在这里用T的原因可能是调整引物的GC含量。 |
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4楼2014-01-05 11:01:56
cicelyzh
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7楼2014-01-06 11:49:42
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GC含量过高有可能导致PCR困难，一般设计引物时考虑在50%左右，其实高于60%的引物也能P出来。尤其是做有些克隆，引物选择的自由度不是很大。只要能P出目的条带就可以了。 大肠杆菌的基因型可以参考： http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes 和TAKARA的免费资料 http://pan.baidu.com/s/1nt7CWI1 |
9楼2014-01-08 01:39:00
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解释非常详细，谢谢你。我还有问题 1、是Tm值、GC含量，PPT中看是未加酶切位点和保护碱基时就计算的，补加碱基防止移码时补什么看GC含量，这是的GC含量是要计算一下含酶切位点什么的吗？ 2、酶切位点、保护碱基中GC含量高，那么实验中退火温度（不含酶切位点算的Tm）是不是5个循环后提高温度？提高多少合适？ 3、Primer1: 5’ cgcggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA 引物设计中说3‘端以A结尾不好，是不是直接去掉这个就行？出于简并性考虑，引物3’端不要终止于密码子第三位，可是从哪个地方开始数呢，这个引物扩增出的片段插入BamHI位点，是从GGATTC开始数吗？ |
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