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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物设计实例分析
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lingbi

银虫 (正式写手)

[求助] 引物设计实例分析已有1人参与

发现一个很好的引物设计的PPT，传上来跟大家分析一下，同时我有几个点没看懂，也想请明白的朋友给指点一下。
目的：
将plasmid 2上GFP基因扩下来连到plasmid 1 上

GFP基因 5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC …………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA  3’
问题一：
Primer1: 5’    ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..
Primer2: 5’    Sample TextTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….   引物2  TTA为什么去掉？不需要终止密码子吗？
问题二加酶切位点后：
Primer1:  5’ ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA     添加酶切位点后为什么在primer1的酶切位点后面加个 T 呢？是为了三个一组ATG刚好一组吗？为什么加的是T不是别的？
Primer2:  5’gg atc cctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC为何在primer2的酶切位点后加CT？这有何讲究？

问题叙述的也许不清楚，请大侠
参看PPT给解释一下吧。谢谢
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  • 附件 1 : 引物设计实例分析.ppt
    • 2014-01-03 15:21:18, 215 K

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@cicelyzh

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1楼2014-01-03 15:25:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-01-05 15:18:33
gyesang: 回帖置顶 2014-01-05 15:18:35
lingbi: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-01-07 22:14:00
lingbi: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2014-01-07 22:14:14
1. TAA是终止密码子，去掉的原因可能是要在基因后面融合表达标签或者其他基因。用后面基因的终止密码子就可以了。
2. 在酶切位点与ATG之间加碱基一般是考虑移码的问题。情况大概是由于在这个基因前面有其他基因或者标签需要融合表达。在基因的反向引物的酶切位点之后加碱基也是考虑移码是问题，大概基因后面有表达标签或者融合蛋白。具体是什么碱基问题不是很大。主要考虑不能形成终止密码子。我想在这里用T的原因可能是调整引物的GC含量。
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lingbi
4楼2014-01-05 11:01:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lingbi at 2014-01-06 09:58:49
解释非常详细，谢谢你。我还有问题

1、是Tm值、GC含量，PPT中看是未加酶切位点和保护碱基时就计算的，补加碱基防止移码时补什么看GC含量，这是的GC含量是要计算一下含酶切位点什么的吗？
2、酶切位点、保护碱基 ...

1. 主要看整体，包括酶切位点和保护碱基。
2. 设计的酶切位点和保护碱基在PCR初期不能与模板配对，所以计算PCR的退火温度时要去掉。过若干循环后，扩增产物的浓度超过原模板，引物中的酶切位点和保护碱基序列可以与模板配对，退火温度可以根据含有这些序列的Tm来考虑。
3. 3'端最好不要是A主要是基于即使错配也能延伸，如果用高保真酶的话，问题应该不大。考虑简并性，是从ATG数起。酶切位点序列是为了方便分子操作，与你要克隆的基因无关。
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7楼2014-01-06 11:49:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lingbi at 2014-01-07 22:22:49
非常感谢你的解答，解释的非常清楚，受教了。
设计的时候常提GC含量，这个实例里边好像没怎么看到哪里要额外注意呀？是不是再加上酶切位点、保护碱基的时候引物的GC含量低于60%就不用担心了？
另外，想请教一下， ...

GC含量过高有可能导致PCR困难，一般设计引物时考虑在50%左右，其实高于60%的引物也能P出来。尤其是做有些克隆，引物选择的自由度不是很大。只要能P出目的条带就可以了。
大肠杆菌的基因型可以参考：
http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes
和TAKARA的免费资料
http://pan.baidu.com/s/1nt7CWI1
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9楼2014-01-08 01:39:00
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lingbi

银虫 (正式写手)
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2楼2014-01-04 10:02:48
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lingbi

银虫 (正式写手)
想了一下，引物设计上密切位点与ATG之间增加碱基是不是考虑密码子移位？可是翻译的时候不是从ATG开始的吗？识别密码子也从这开始，它前面增加碱基不起作用呀？

谁能帮帮忙给说说呀？
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3楼2014-01-05 09:07:54
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gyl121

新虫 (正式写手)
恩，学习了，专家说的很透彻嘛，有用，学习
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不经一番寒彻骨，怎得梅花扑鼻香？为科学进步不懈努力
5楼2014-01-05 22:03:30
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lingbi

银虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-05 11:01:56
1. TAA是终止密码子，去掉的原因可能是要在基因后面融合表达标签或者其他基因。用后面基因的终止密码子就可以了。
2. 在酶切位点与ATG之间加碱基一般是考虑移码的问题。情况大概是由于在这个基因前面有其他基因或者 ...

解释非常详细，谢谢你。我还有问题

1、是Tm值、GC含量，PPT中看是未加酶切位点和保护碱基时就计算的，补加碱基防止移码时补什么看GC含量，这是的GC含量是要计算一下含酶切位点什么的吗？
2、酶切位点、保护碱基中GC含量高，那么实验中退火温度（不含酶切位点算的Tm）是不是5个循环后提高温度？提高多少合适？
3、Primer1:  5’ cgcggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA  引物设计中说3‘端以A结尾不好，是不是直接去掉这个就行？出于简并性考虑，引物3’端不要终止于密码子第三位，可是从哪个地方开始数呢，这个引物扩增出的片段插入BamHI位点，是从GGATTC开始数吗？
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6楼2014-01-06 09:58:49
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lingbi

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2014-01-06 11:49:42
1. 主要看整体，包括酶切位点和保护碱基。
2. 设计的酶切位点和保护碱基在PCR初期不能与模板配对，所以计算PCR的退火温度时要去掉。过若干循环后，扩增产物的浓度超过原模板，引物中的酶切位点和保护碱基序列可以 ...

非常感谢你的解答，解释的非常清楚，受教了。
设计的时候常提GC含量，这个实例里边好像没怎么看到哪里要额外注意呀？是不是再加上酶切位点、保护碱基的时候引物的GC含量低于60%就不用担心了？
另外，想请教一下，做表达的时候看到大肠杆菌基因型什么的，看不大懂，请问是哪门课程讲的？我不是生物类专业的基础差，还望指点一二。
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8楼2014-01-07 22:22:49
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15195997166
10楼2014-01-09 15:03:32
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