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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助引物设计：前前后后三次都有问题，请大神帮帮忙…………感激不尽
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肖thest

木虫 (小有名气)

神级

[求助] 求助引物设计：前前后后三次都有问题，请大神帮帮忙…………感激不尽 已有2人参与

共1067bp， 粗线是我需要看的基因区域，想设计一对引物，普通PCR后测序（单向测，所以上游或者下游引物离目标区域起码60bp），用primer或者NCBI primer blast设计了三次，每次引物特异性较差或者退火温度摸不出来。
下面是我的序列：
TGAGACTTTT CCGTTGCCGC TGGGAGCCGG AGGCGCGGGG ACCTCTTGGC GCGACGCTGC
CCCGCGAGGA GGCAGGACTT GGGGACCCCA GACCGCCTCC CTTTGCCGCC GGGGACGCTT
GCTCCCTCCC TGCCCCCTAC ACGGCGTCCC TCAGGCGCCC CCATTCCGGA CCAGCCCTCG
GGAGTCGCCG ACCCGGCCTC CCGCAAAGAC TTTTCCCCAG ACCTCGGGCG CACCCCCTGC
ACGCCGCCTT CATCCCCGGC CTGTCTCCTG AGCCCCCGCG CATCCTAGAC CCTTTCTCCT
CCAGGAGACG GATCTCTCTC CGACCTGCCA CAGATCCCCT ATTCAAGACC ACCCACCTTC
TGGTACCAGA TCGCGCCCAT CTAGGTTATT TCCGTGGGAT ACTGAGACAC CCCCGGTCCA
AGCCTCCCCT CCACCACTGC GCCCTTCTCC CTGAGGACCT CAGCTTTCCC TCGAGGCCCT
CCTACCTTTT GCCGGGAGAC CCCCAGCCCC TGCAGGGGCG GGGCCTCCCC ACCACACCAG
CCCTGTTCGC GCTCTCGGCA GTGCCGGGGG GCGCCGCCTC CCCCATGCCG CCCTCCGGgc
tgcggctgct gcCgctgctgcta ccgctgctgt ggctactggt gctgACGCCT GGCCGGCCGG CCGCGGGACT
ATCCACCTGC AAGACTATCG ACATGGAGCT GGTGAAGCGG AAGCGCATCG AGGCCATCCG
CGGCCAGATC CTGTCCAAGC TGCGGCTCGC CAGCCCCCCG AGCCAGGGGG AGGTGCCGCC
CGGCCCGCTG CCCGAGGCCG TGCTCGCCCT GTACAACAGC ACCCGCGACC GGGTGGCCGG
GGAGAGTGCA GAACCGGAGC CCGAGCCTGA GGCCGACTAC TACGCCAAGG AGGTCACCCG
CGTGCTAATG GTGGAAACCC ACAACGGTGA GCTCGGAGGG GCAGGGGAGC CGGGAGGGGG
GCCCCCAGGG GGCGCCGGAG TGCCGGGGCC ACGGGTAGGA AGTGACTGGC AGAAGAAACT
GGCTGGAGGA AGAGGACACC CCGGGGCAAA GGGA

[ Last edited by 肖thest on 2013-12-22 at 13:43 ]
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thest
1楼 2013-12-22 13:42:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Dr.G

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

PCR仪可以梯度的话，建议梯度PCR试一下，试试能不能扩出你要的条带
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28楼2013-12-22 23:58:07
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普通回帖

woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
肖thest: 金币+15, ★★★★★最佳答案, 很感激，很nice的人 2013-12-22 23:13:55
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:45:26
上游：AAGCCTCCCCTCCACCACTG
下游：CCGCAGCTTGGACAGGATCT
肯定能出来
出不来你再联系我
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肖thest
2楼2013-12-22 18:35:26
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肖thest

木虫 (小有名气)

神级
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-22 18:35:26
上游：AAGCCTCCCCTCCACCACTG
下游：CCGCAGCTTGGACAGGATCT
肯定能出来
出不来你再联系我

回复，很感谢，但是我看了您设计的结果，因为粗线是我要看的目标区域，可您设计的好像是338bp，我的目标区域没有包括全哦。还是很谢谢
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thest
3楼2013-12-22 19:48:34
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肖thest

木虫 (小有名气)

神级
引用回帖:
3楼: Originally posted by 肖thest at 2013-12-22 19:48:34
回复，很感谢，但是我看了您设计的结果，因为粗线是我要看的目标区域，可您设计的好像是338bp，我的目标区域没有包括全哦。还是很谢谢...

我在分析下，好像看错了。呜呜，我blast下
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thest
4楼2013-12-22 19:52:31
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woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你不是说黑体的是你想要的吗？
难不成上面的序列你全部想要？
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5楼2013-12-22 19:53:05
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肖thest

木虫 (小有名气)

神级
引用回帖:
2楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-22 18:35:26
上游：AAGCCTCCCCTCCACCACTG
下游：CCGCAGCTTGGACAGGATCT
肯定能出来
出不来你再联系我

我在分析下，好像看错了。呜呜，我blast下
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thest
6楼2013-12-22 19:53:06
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肖thest

木虫 (小有名气)

神级
引用回帖:
5楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-22 19:53:05
你不是说黑体的是你想要的吗？
难不成上面的序列你全部想要？

是黑体的，好像我弄错了。
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thest
7楼2013-12-22 19:53:43
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woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我已经把黑体全部包括进去了，你送任何一家公司测，正常的结果都能得到你想要的。
我做了很长时间这个的。
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肖thest
8楼2013-12-22 19:55:48
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woshishui916

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你好像是学临床的吧？
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9楼2013-12-22 19:56:54
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肖thest

木虫 (小有名气)

神级
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by woshishui916 at 2013-12-22 19:55:48
我已经把黑体全部包括进去了，你送任何一家公司测，正常的结果都能得到你想要的。
我做了很长时间这个的。

好的，我就直接合成引物了，谢谢您，然后pcr之后测序。我前面自己设计的结果blast都还不错，但是退火温度从45-65℃摸，就是不行。因为刚才用您的引物blast没成功，不知道是不是我哪里弄错了。
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thest
10楼2013-12-22 20:01:11
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