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引物设计问题 已有2人参与
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请教一下各位师兄师姐，我要扩增一段基因，在gene bank里查询到mRNA长度为3590bp，CDS从61到3028bp，我需要设计一对特异性引物包含该基因所有片段，那么，我设计的时候是不是只能从61bp和3028bp处开始寻找较好的引物呢？这样的话引物几乎固定了，选择的范围就很小了，只能是增加减少碱基的区别，设计出来的引物很多found，怎么办呢？ 如果从CDS序列中间寻找较好的引物，只能扩出其中的一部分，我需要做该基因的克隆、原核表达及免疫效果，只用其中一部分是不是没有说服力，必须扩增出全部呢？ 另外在5‘端设计酶切位点时，用不用考虑对引物TM值的影响呢？加入酶切位点以后，5’端还需要保护碱基吗（酶切位点分别是BamHI、EcoRI） 刚进实验室的小白，请各位大神不吝赐教，小妹一定虚心接受批评建议。跪谢。 |
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-08 22:24:28
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-05-08 22:24:28
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1.cDNA是包含5‘UTR区和3'UTR区的。 2.直接在61和3028处设计引物的话，可能找不到合适的引物，就像你说的有很多fund，这样会影响扩增效率；另外，这一步PCR时用的模板是cDNA，是各种cDNA的混合物，模板复杂，易错配，也会影响扩增结果。综上，这样直接设计引物扩经常会出现扩不出或扩出非目标带的问题，导致实验无法继续。先设计特异性好、扩增效率高的引物把序列得到，连到载体上，以载体为模板，再以61和3028处的引物去扩，这样因为模板是单一的，即使引物不是很合适，仍能得到高效扩增。 3.3000是长，但也不是不能扩，所以更要按我说的方法扩。有全长就不用做RACE了，或者你可以用重叠PCR试试，把你的3000多序列分两次扩，然后再扩全长。 |
4楼2015-05-08 13:09:14
