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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 做的TA克隆，一直连不上
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NSDSKY_LZM

金虫 (小有名气)

[求助] 做的TA克隆，一直连不上 已有5人参与

最近在做TA克隆，用的全式金的PMD19-T载体，我的目的基因片段为300bp左右，浓度为30ng/ul，体系为 DNA 4.5ul，solutionI 5ul，PMD19-t 0.5ul，16℃过夜，用的感受态为Trans1-t1，菌落PCR，没有见到我的目的条带，已经挑取10多个菌落了，都没有，这是为什么？
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1楼 2015-04-23 16:08:12
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
NSDSKY_LZM(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-29 18:45:52
同学，你用的产品、体系都没问题，我一直有做，和你用的试剂也一样。
给你点建议你参考一下：自己的DNA浓度或者质量提高一下（重新PCR，多做几管浓缩等），PMD-19T加至0.8微升。
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2楼2015-04-23 16:48:50
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NSDSKY_LZM

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-04-23 16:48:50
同学，你用的产品、体系都没问题，我一直有做，和你用的试剂也一样。
给你点建议你参考一下：自己的DNA浓度或者质量提高一下（重新PCR，多做几管浓缩等），PMD-19T加至0.8微升。

那DNA加多少？你的DNA浓度是多少？
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3楼2015-04-26 16:20:18
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by NSDSKY_LZM at 2015-04-26 16:20:18
那DNA加多少？你的DNA浓度是多少？...

DNA4.5微，浓度80的，链接是高一点成功率高
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4楼2015-04-26 17:14:03
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sx65781915

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
NSDSKY_LZM(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-29 18:46:04
你的条带确定是单一的么？如果是条带不亮或者你切胶的时候切了其他的大小近似条带就肯定连不上。

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2015-04-26 17:38:24
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NSDSKY_LZM

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by sx65781915 at 2015-04-26 17:38:24
你的条带确定是单一的么？如果是条带不亮或者你切胶的时候切了其他的大小近似条带就肯定连不上。

条带是单一的
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6楼2015-04-26 18:56:37
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NSDSKY_LZM

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-04-26 17:14:03
DNA4.5微，浓度80的，链接是高一点成功率高...

载体提高到0.8uL，DNA4.5uL，solutionI是4.7uL吗？
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7楼2015-04-26 18:58:33
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by NSDSKY_LZM at 2015-04-26 18:58:33
载体提高到0.8uL，DNA4.5uL，solutionI是4.7uL吗？...

2X的，当然是5微升了，这只是我一直用的体系，还挺顺利的。如果插入片段大于1000bp，我会用1微升以上的载体，另两个组份不变。
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8楼2015-04-26 19:50:08
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-04-26 19:50:08
2X的，当然是5微升了，这只是我一直用的体系，还挺顺利的。如果插入片段大于1000bp，我会用1微升以上的载体，另两个组份不变。...

请问一下我一直都是这样做的，但是有个问题，每次连接转化之后，涂平板，1小时后蓝白斑筛选的时候总是没有蓝的这是为啥？还有挑菌后，用氨苄培养基摇菌，为什么我的菌液老是沉在底部，都不是浑浊的，而且量很难变多，能不能上传一张涂平板后的图片给我看看是着么样的，谢谢
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9楼2015-04-26 21:15:39
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你用的什么酶做PCR

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2015-04-27 14:42:18
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