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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 做的TA克隆，一直连不上
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NSDSKY_LZM

金虫 (小有名气)

[求助] 做的TA克隆，一直连不上 已有5人参与

最近在做TA克隆，用的全式金的PMD19-T载体，我的目的基因片段为300bp左右，浓度为30ng/ul，体系为 DNA 4.5ul，solutionI 5ul，PMD19-t 0.5ul，16℃过夜，用的感受态为Trans1-t1，菌落PCR，没有见到我的目的条带，已经挑取10多个菌落了，都没有，这是为什么？
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1楼 2015-04-23 16:08:12
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qaz139687

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-04-26 19:50:08
2X的，当然是5微升了，这只是我一直用的体系，还挺顺利的。如果插入片段大于1000bp，我会用1微升以上的载体，另两个组份不变。...

请问一下我一直都是这样做的，但是有个问题，每次连接转化之后，涂平板，1小时后蓝白斑筛选的时候总是没有蓝的这是为啥？还有挑菌后，用氨苄培养基摇菌，为什么我的菌液老是沉在底部，都不是浑浊的，而且量很难变多，能不能上传一张涂平板后的图片给我看看是着么样的，谢谢
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9楼2015-04-26 21:15:39
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
NSDSKY_LZM(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-29 18:45:52
同学，你用的产品、体系都没问题，我一直有做，和你用的试剂也一样。
给你点建议你参考一下：自己的DNA浓度或者质量提高一下（重新PCR，多做几管浓缩等），PMD-19T加至0.8微升。
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2楼2015-04-23 16:48:50
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NSDSKY_LZM

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-04-23 16:48:50
同学，你用的产品、体系都没问题，我一直有做，和你用的试剂也一样。
给你点建议你参考一下：自己的DNA浓度或者质量提高一下（重新PCR，多做几管浓缩等），PMD-19T加至0.8微升。

那DNA加多少？你的DNA浓度是多少？
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3楼2015-04-26 16:20:18
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by NSDSKY_LZM at 2015-04-26 16:20:18
那DNA加多少？你的DNA浓度是多少？...

DNA4.5微，浓度80的，链接是高一点成功率高
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4楼2015-04-26 17:14:03
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