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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 培养/筛选 » 基因敲除中转化子的筛选
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星乐之梦

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除中转化子的筛选 已有2人参与

最近在做基因敲除的实验，利用的是同源重组的方法，所用的质粒载体是PDS3.0。（含有庆大抗性以及对蔗糖的敏感性）也就是说在双亲本杂交后目的转化子应该抗庆大，对蔗糖敏感。可是接合后疑似转化子的确可以在庆大的板子上生长，但奇怪的是在蔗糖的的平板中也可以而且长势基本一致。做了几次都是这样，无法挑真正取转化子，还请各位大神不吝赐教。在此谢过！
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1楼 2015-04-20 10:36:39
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王丹2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2015-04-25 21:25:37
星乐之梦: 金币+2, ★有帮助 2015-04-27 08:29:50
可能你的受体菌耐渗透压能力很强，这种情况下就不适合用蔗糖平板筛选了。建议先提高蔗糖浓度，如果发现转化子还是长势一致就果断换载体。
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3楼2015-04-21 15:37:55
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
星乐之梦: 金币+3, ★有帮助 2015-04-27 08:29:41
得到的转化子是多种类型的，有抗性不一定是真正的发生了同源重组的，而可能是抗性基因随机插入了目标基因组的，且这种转化子往往是占大多数的。要想得到真正的同源重组后的转化子，需要做相关验证，如：PCR，杂交（blot杂交或者Southern杂交）
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2楼2015-04-21 12:55:01
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星乐之梦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 棒哈哈 at 2015-04-21 12:55:01
得到的转化子是多种类型的，有抗性不一定是真正的发生了同源重组的，而可能是抗性基因随机插入了目标基因组的，且这种转化子往往是占大多数的。要想得到真正的同源重组后的转化子，需要做相关验证，如：PCR，杂交（ ...

可是抗性基因是载体质粒上的，总不能脱离质粒独自进入宿主基因组吧，而且之后我也做过PCR验证结果表明重组质粒确实也导入基因组中，但对蔗糖的敏感性却无法解释。去年做的还好好的，今年做就变成了这样，感觉是不是菌让我放久了敏感性丧失了。。。
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4楼2015-04-21 17:33:35
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星乐之梦

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王丹2013 at 2015-04-21 15:37:55
可能你的受体菌耐渗透压能力很强，这种情况下就不适合用蔗糖平板筛选了。建议先提高蔗糖浓度，如果发现转化子还是长势一致就果断换载体。

可是上学期我做的时候就不会出现这种情况，接合后受体菌由于质粒对蔗糖的敏感性在15%蔗糖中是不长的或是很弱的，也就说双亲本杂交后总是能轻松筛选到转化子，这学期不知道怎么了，状况百出。到底是受体菌，还是重组质粒的问题呢？
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5楼2015-04-21 17:39:55
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