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星乐之梦

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除中转化子的筛选 已有2人参与

最近在做基因敲除的实验,利用的是同源重组的方法,所用的质粒载体是PDS3.0。(含有庆大抗性以及对蔗糖的敏感性)也就是说在双亲本杂交后目的转化子应该抗庆大,对蔗糖敏感。可是接合后疑似转化子的确可以在庆大的板子上生长,但奇怪的是在蔗糖的的平板中也可以而且长势基本一致。做了几次都是这样,无法挑真正取转化子,还请各位大神不吝赐教。在此谢过!
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棒哈哈

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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星乐之梦: 金币+3, 有帮助 2015-04-27 08:29:41
得到的转化子是多种类型的,有抗性不一定是真正的发生了同源重组的,而可能是抗性基因随机插入了目标基因组的,且这种转化子往往是占大多数的。要想得到真正的同源重组后的转化子,需要做相关验证,如:PCR,杂交(blot杂交或者Southern杂交)
2楼2015-04-21 12:55:01
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王丹2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2015-04-25 21:25:37
星乐之梦: 金币+2, 有帮助 2015-04-27 08:29:50
可能你的受体菌耐渗透压能力很强,这种情况下就不适合用蔗糖平板筛选了。建议先提高蔗糖浓度,如果发现转化子还是长势一致就果断换载体。
3楼2015-04-21 15:37:55
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星乐之梦

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 棒哈哈 at 2015-04-21 12:55:01
得到的转化子是多种类型的,有抗性不一定是真正的发生了同源重组的,而可能是抗性基因随机插入了目标基因组的,且这种转化子往往是占大多数的。要想得到真正的同源重组后的转化子,需要做相关验证,如:PCR,杂交( ...

可是抗性基因是载体质粒上的,总不能脱离质粒独自进入宿主基因组吧,而且之后我也做过PCR验证结果表明重组质粒确实也导入基因组中,但对蔗糖的敏感性却无法解释。去年做的还好好的,今年做就变成了这样,感觉是不是菌让我放久了敏感性丧失了。。。
4楼2015-04-21 17:33:35
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星乐之梦

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 王丹2013 at 2015-04-21 15:37:55
可能你的受体菌耐渗透压能力很强,这种情况下就不适合用蔗糖平板筛选了。建议先提高蔗糖浓度,如果发现转化子还是长势一致就果断换载体。

可是上学期我做的时候就不会出现这种情况,接合后受体菌由于质粒对蔗糖的敏感性在15%蔗糖中是不长的或是很弱的,也就说双亲本杂交后总是能轻松筛选到转化子,这学期不知道怎么了,状况百出。到底是受体菌,还是重组质粒的问题呢?
5楼2015-04-21 17:39:55
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王丹2013

金虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 星乐之梦 at 2015-04-21 17:39:55
可是上学期我做的时候就不会出现这种情况,接合后受体菌由于质粒对蔗糖的敏感性在15%蔗糖中是不长的或是很弱的,也就说双亲本杂交后总是能轻松筛选到转化子,这学期不知道怎么了,状况百出。到底是受体菌,还是重组 ...

那你就先验证下受体菌对不对,如果是对的那就把蔗糖浓度提高到20%或25%
6楼2015-04-21 19:28:12
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星乐之梦

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 王丹2013 at 2015-04-21 19:28:12
那你就先验证下受体菌对不对,如果是对的那就把蔗糖浓度提高到20%或25%...

好吧,我试一下,但愿受体菌最后不会产生因为蔗糖浓度过高而被物理性的”压“死了的假象。
7楼2015-04-22 10:25:49
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yanbiyun85

新虫 (正式写手)

我是新手,最近有准备在做敲除,是一个双核食用菌,能否发点敲除的资料供参考,谢谢
8楼2015-04-24 09:05:16
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星乐之梦

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by yanbiyun85 at 2015-04-24 09:05:16
我是新手,最近有准备在做敲除,是一个双核食用菌,能否发点敲除的资料供参考,谢谢

你可以参考下这篇文献,希望对你有帮助。

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  • 2015-04-24 16:22:58, 378.59 K
9楼2015-04-24 16:23:33
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