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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

[求助] 蛋白原核表达 已有3人参与

最近在做蛋白质原核表达,目的蛋白80KD ,选用pGEX-4T-1载体、21度 、终浓度0.1mM IPTG 诱导过夜 ,SDS-PAGE发现上清中也有蛋白 ,但是表达量不多
,将得到的上清蛋白和GST beads 孵育  ,蛋白几乎不和GST-beads 结合 。请问是什么原因 ?
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岁月静好
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781055707

木虫 (著名写手)

楼主pGEX-4T-1载体可以给我一点吗?我可以给你pet28a质粒和BL21(DE3)的感受态。邮费都我出。
采菊东篱下,悠然见南山。
4楼2015-03-21 17:29:02
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普通回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可能只是大小一样,但不是目的蛋白吧。
采菊东篱下,悠然见南山。
2楼2015-03-21 17:26:36
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-21 17:26:36
可能只是大小一样,但不是目的蛋白吧。

是说我的蛋白没有表达的意思么?
岁月静好
3楼2015-03-21 17:28:13
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781055707

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by Phoebe.Lee at 2015-03-21 17:28:13
是说我的蛋白没有表达的意思么?...

不是,在上清里的可能不是,你的蛋白可能在沉淀里。
采菊东篱下,悠然见南山。
5楼2015-03-21 17:30:01
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781055707

木虫 (著名写手)

蛋白几乎不和GST-beads 结合,你是做了Western blotting吗,那也可能是单抗或二抗的问题。
采菊东篱下,悠然见南山。
6楼2015-03-21 17:32:06
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

引用回帖:
5楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-21 17:30:01
不是,在上清里的可能不是,你的蛋白可能在沉淀里。...

沉淀里也有 和上清比量差的不是特别多 同学说我的诱导条件不是很理想要再摸下 我的主要疑问是为什么GST beads 拉不下来融合蛋白  是不是诱导温度高了 导致蛋白折叠错误 影响和beads 结合?
岁月静好
7楼2015-03-21 17:36:26
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

引用回帖:
6楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-21 17:32:06
蛋白几乎不和GST-beads 结合,你是做了Western blotting吗,那也可能是单抗或二抗的问题。

没有做western
岁月静好
8楼2015-03-21 17:37:05
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-21 17:29:02
楼主pGEX-4T-1载体可以给我一点吗?我可以给你pet28a质粒和BL21(DE3)的感受态。邮费都我出。

可以啊  可是载体菌液要怎么寄?
岁月静好
9楼2015-03-21 17:39:29
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781055707

木虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by Phoebe.Lee at 2015-03-21 17:36:26
沉淀里也有 和上清比量差的不是特别多 同学说我的诱导条件不是很理想要再摸下 我的主要疑问是为什么GST beads 拉不下来融合蛋白  是不是诱导温度高了 导致蛋白折叠错误 影响和beads 结合?...

诱导条件没什么大问题,你可以试下1MOL诱导,pGEX-4T-1载体里自带的GST 不会蛋白折叠错误,也可能是GST beads 出问题了,你可以买个GST 的1抗,做个Western。
采菊东篱下,悠然见南山。
10楼2015-03-21 17:42:57
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