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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 蛋白原核表达
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。

[求助] 蛋白原核表达 已有3人参与

最近在做蛋白质原核表达，目的蛋白80KD ，选用pGEX-4T-1载体、21度 、终浓度0.1mM IPTG 诱导过夜 ，SDS-PAGE发现上清中也有蛋白 ，但是表达量不多
，将得到的上清蛋白和GST beads 孵育  ，蛋白几乎不和GST-beads 结合 。请问是什么原因 ？
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岁月静好
1楼 2015-03-21 17:23:20
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781055707

木虫 (著名写手)
楼主pGEX-4T-1载体可以给我一点吗？我可以给你pet28a质粒和BL21(DE3)的感受态。邮费都我出。
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-03-21 17:29:02
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能只是大小一样，但不是目的蛋白吧。
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2015-03-21 17:26:36
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-21 17:26:36
可能只是大小一样，但不是目的蛋白吧。

是说我的蛋白没有表达的意思么？
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岁月静好
3楼2015-03-21 17:28:13
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Phoebe.Lee at 2015-03-21 17:28:13
是说我的蛋白没有表达的意思么？...

不是，在上清里的可能不是，你的蛋白可能在沉淀里。
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采菊东篱下，悠然见南山。
5楼2015-03-21 17:30:01
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781055707

木虫 (著名写手)
蛋白几乎不和GST-beads 结合，你是做了Western blotting吗，那也可能是单抗或二抗的问题。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2015-03-21 17:32:06
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
5楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-21 17:30:01
不是，在上清里的可能不是，你的蛋白可能在沉淀里。...

沉淀里也有 和上清比量差的不是特别多 同学说我的诱导条件不是很理想要再摸下 我的主要疑问是为什么GST beads 拉不下来融合蛋白  是不是诱导温度高了 导致蛋白折叠错误 影响和beads 结合？
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岁月静好
7楼2015-03-21 17:36:26
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
6楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-21 17:32:06
蛋白几乎不和GST-beads 结合，你是做了Western blotting吗，那也可能是单抗或二抗的问题。

没有做western
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岁月静好
8楼2015-03-21 17:37:05
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Phoebe.Lee

金虫 (小有名气)

。。。
引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-21 17:29:02
楼主pGEX-4T-1载体可以给我一点吗？我可以给你pet28a质粒和BL21(DE3)的感受态。邮费都我出。

可以啊  可是载体菌液要怎么寄？
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岁月静好
9楼2015-03-21 17:39:29
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Phoebe.Lee at 2015-03-21 17:36:26
沉淀里也有 和上清比量差的不是特别多 同学说我的诱导条件不是很理想要再摸下 我的主要疑问是为什么GST beads 拉不下来融合蛋白  是不是诱导温度高了 导致蛋白折叠错误 影响和beads 结合？...

诱导条件没什么大问题，你可以试下1MOL诱导，pGEX-4T-1载体里自带的GST 不会蛋白折叠错误，也可能是GST beads 出问题了，你可以买个GST 的1抗，做个Western。
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采菊东篱下，悠然见南山。
10楼2015-03-21 17:42:57
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