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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求原核表达诱导表达具体操作？？？
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草帽小子

银虫 (小有名气)

[求助] 求原核表达诱导表达具体操作？？？

我选择的PET32a，把我差不多600bp的目的片段连入了pet32a。转化入表达菌株Rosset。下一步就是要做诱导表达了！可是我从来都没做过，还是有好多的细节不清楚啊！惶恐，求高人指点！我看别人的文章里用到1XPBS，2XSDS，不知道1XPBS和2XSDS的配方是怎样的？？Sample Text因为是差不多600bp，所以我的目的蛋白应该是21KD左右。不知道选择PET32a载体，前面是否会多编码一段蛋白啊？我的目的序列是从ATG开始的！我应该选择分离胶和浓缩胶的浓度各是多大喃？在SDS-PAGE过程中，缓冲液用的是什么啊？什么样的配方啊？我应该怎样安排对照比较好喃？有什么特别要注意的么？求高人指点！
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海贼王，我当定了
1楼 2012-06-04 12:03:25
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zhoucb

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

草帽小子
2楼2012-06-04 12:33:38
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jiangyhai

金虫 (著名写手)
可以和我聊聊。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

草帽小子
静心做事。
3楼2012-06-04 12:52:20
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-04 13:42:34
草帽小子: 金币+10, ★有帮助, 很感谢！ 2012-06-04 16:31:57
pET32，如果你用NdeI插入的话，那就不会多编码，用其他的会多出一段TrxA标签，大约11kDa吧，具体请看pET32的图谱。
1×PBS就是磷酸缓冲液，2×SDS就是浓度两倍的SDS母液。
至于诱导表达的标准操作步骤，见分子克隆实验指南
SDS-PAGE电泳技术，具体见蛋白质技术手册
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4楼2012-06-04 13:20:06
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翌日到

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
草帽小子: 金币+5, ★有帮助 2012-06-04 16:31:28
首先你要摸索一下诱导表达的条件，其中温度比较关键，你的蛋白是否可溶以及是否会形成包涵体，这些都要弄明白。有一个蛋白分离范围与胶浓度的对应表，你可以查一下，你的蛋白可以试试12%的分离胶。
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5楼2012-06-04 14:48:26
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草帽小子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 翌日到 at 2012-06-04 14:48:26
首先你要摸索一下诱导表达的条件，其中温度比较关键，你的蛋白是否可溶以及是否会形成包涵体，这些都要弄明白。有一个蛋白分离范围与胶浓度的对应表，你可以查一下，你的蛋白可以试试12%的分离胶。

怎么才能知道我的蛋白是否可溶以及是否会形成包涵体喃？
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海贼王，我当定了
6楼2012-06-04 16:30:50
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
草帽小子: 金币+10, ★★★很有帮助, 谢谢，有问题再请教！ 2012-06-04 16:52:39
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-06-07 13:44:44
http://biotech.ou.edu/ 是预测可溶概率的，当然只是概率
首先看文献啊，别人做过或者类似蛋白是不是包涵体
然后就是跑电泳的时候啊，你跑的全菌，破菌上清，和破菌沉淀里面，目的条带在沉淀里面的，只要不是破菌没破开，那就是包涵体了
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7楼2012-06-04 16:37:00
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草帽小子

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhoucb at 2012-06-04 12:33:38

楼主有何指教？
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海贼王，我当定了
8楼2012-06-04 16:47:53
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草帽小子

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhoucb at 2012-06-04 12:33:38

楼主有何指教？
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海贼王，我当定了
9楼2012-06-04 16:48:28
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草帽小子

银虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by jiangyhai at 2012-06-04 12:52:20
可以和我聊聊。

灰常感谢！我QQ729554881
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海贼王，我当定了
10楼2012-06-04 16:49:46
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