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flll2014

铜虫 (小有名气)

[交流] 蛋白表达纯化问题 已有5人参与

去年做的原核表达,成功构建了表达菌株,诱导表达量很高,纯化效果也较好,就保了菌种,今年直接将菌种活化了,也做pcr鉴定了,再诱导表达怎么表达量变得很低,不知道为什么,而且纯化也没纯化出来,请大家帮帮忙,谢谢!
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pennchem

专家顾问 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
重新转质粒,挑选单克隆,从头再做一遍表达纯化
行至水穷处,坐看云起时
2楼2015-03-12 14:31:46
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lomis

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菌株退化了,可涂抗性版挑几个单克隆再表达,如都较低,再重新构建载体转化。
没有命运,只有选择!
3楼2015-03-12 15:14:37
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flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lomis at 2015-03-12 15:14:37
菌株退化了,可涂抗性版挑几个单克隆再表达,如都较低,再重新构建载体转化。

原先构建的载体质粒也保存了,重新转化会不会好些
4楼2015-03-12 16:20:02
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flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2015-03-12 14:31:46
重新转质粒,挑选单克隆,从头再做一遍表达纯化

好的,谢谢
5楼2015-03-12 16:21:51
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九字江山

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你的保种菌是什么菌?以前我做蛋白表达纯化时也曾出现类似问题:原来是可溶表达,保存后活化再表达却是包涵体。给你以下几个意见:
1. 你酶切鉴定的质粒是你未表达的菌液里提出的吗?
2. 你可以再次划板,挑取阳性克隆多个鉴定后做表达试验。
3. 分析你这次的表达条件是否有所不同。
6楼2015-03-13 15:44:31
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flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-13 15:44:31
你的保种菌是什么菌?以前我做蛋白表达纯化时也曾出现类似问题:原来是可溶表达,保存后活化再表达却是包涵体。给你以下几个意见:
1. 你酶切鉴定的质粒是你未表达的菌液里提出的吗?
2. 你可以再次划板,挑取阳性 ...

我保的是BL21,我也发现和你类似的结果,活化的菌表达蛋白做可溶性分析,上清中的含量降低了很多。我是从未表达的菌液中抽提的质粒,现在做转化了,不知道后面表达怎么样,再次划板还是划我保的菌液吗?挑取多个克隆若鉴定都是阳性的话都要逐个进行表达实验的吗,谢谢
7楼2015-03-13 16:55:03
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九字江山

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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7楼: Originally posted by flll2014 at 2015-03-13 16:55:03
我保的是BL21,我也发现和你类似的结果,活化的菌表达蛋白做可溶性分析,上清中的含量降低了很多。我是从未表达的菌液中抽提的质粒,现在做转化了,不知道后面表达怎么样,再次划板还是划我保的菌液吗?挑取多个克 ...

BL21(DE3)或BL21不适合作保种用,是表达用菌,容易出现质粒丢失的情况。先试试转化后的吧,当初我是重新做的。。。
8楼2015-03-13 17:20:23
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flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-13 17:20:23
BL21(DE3)或BL21不适合作保种用,是表达用菌,容易出现质粒丢失的情况。先试试转化后的吧,当初我是重新做的。。。...

你是重新构建的载体再做的吗?我是第一次做表达时就把质粒提出来了,质粒和菌种都保存的,现在应该重新转化下就可以了吧。你重新做后效果好了吗
9楼2015-03-13 21:00:56
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九字江山

银虫 (小有名气)



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引用回帖:
9楼: Originally posted by flll2014 at 2015-03-13 21:00:56
你是重新构建的载体再做的吗?我是第一次做表达时就把质粒提出来了,质粒和菌种都保存的,现在应该重新转化下就可以了吧。你重新做后效果好了吗...

是啊,重组后就成功了。祝你好运
10楼2015-03-16 09:05:22
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