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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白表达纯化问题
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flll2014

铜虫 (小有名气)

[交流] 蛋白表达纯化问题已有5人参与

去年做的原核表达，成功构建了表达菌株，诱导表达量很高，纯化效果也较好，就保了菌种，今年直接将菌种活化了，也做pcr鉴定了，再诱导表达怎么表达量变得很低，不知道为什么，而且纯化也没纯化出来，请大家帮帮忙，谢谢！
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1楼2015-03-12 12:45:22
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
重新转质粒，挑选单克隆，从头再做一遍表达纯化
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2015-03-12 14:31:46
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lomis

木虫 (正式写手)
★
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菌株退化了，可涂抗性版挑几个单克隆再表达，如都较低，再重新构建载体转化。
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没有命运，只有选择！
3楼2015-03-12 15:14:37
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lomis at 2015-03-12 15:14:37
菌株退化了，可涂抗性版挑几个单克隆再表达，如都较低，再重新构建载体转化。

原先构建的载体质粒也保存了，重新转化会不会好些
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4楼2015-03-12 16:20:02
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2015-03-12 14:31:46
重新转质粒，挑选单克隆，从头再做一遍表达纯化

好的，谢谢
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5楼2015-03-12 16:21:51
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九字江山

银虫 (小有名气)
★
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你的保种菌是什么菌？以前我做蛋白表达纯化时也曾出现类似问题：原来是可溶表达，保存后活化再表达却是包涵体。给你以下几个意见：
1. 你酶切鉴定的质粒是你未表达的菌液里提出的吗？
2. 你可以再次划板，挑取阳性克隆多个鉴定后做表达试验。
3. 分析你这次的表达条件是否有所不同。
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6楼2015-03-13 15:44:31
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-13 15:44:31
你的保种菌是什么菌？以前我做蛋白表达纯化时也曾出现类似问题：原来是可溶表达，保存后活化再表达却是包涵体。给你以下几个意见：
1. 你酶切鉴定的质粒是你未表达的菌液里提出的吗？
2. 你可以再次划板，挑取阳性 ...

我保的是BL21，我也发现和你类似的结果，活化的菌表达蛋白做可溶性分析，上清中的含量降低了很多。我是从未表达的菌液中抽提的质粒，现在做转化了，不知道后面表达怎么样，再次划板还是划我保的菌液吗？挑取多个克隆若鉴定都是阳性的话都要逐个进行表达实验的吗，谢谢
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7楼2015-03-13 16:55:03
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九字江山

银虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
7楼: Originally posted by flll2014 at 2015-03-13 16:55:03
我保的是BL21，我也发现和你类似的结果，活化的菌表达蛋白做可溶性分析，上清中的含量降低了很多。我是从未表达的菌液中抽提的质粒，现在做转化了，不知道后面表达怎么样，再次划板还是划我保的菌液吗？挑取多个克 ...

BL21(DE3)或BL21不适合作保种用，是表达用菌，容易出现质粒丢失的情况。先试试转化后的吧，当初我是重新做的。。。
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8楼2015-03-13 17:20:23
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flll2014

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-13 17:20:23
BL21(DE3)或BL21不适合作保种用，是表达用菌，容易出现质粒丢失的情况。先试试转化后的吧，当初我是重新做的。。。...

你是重新构建的载体再做的吗？我是第一次做表达时就把质粒提出来了，质粒和菌种都保存的，现在应该重新转化下就可以了吧。你重新做后效果好了吗
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9楼2015-03-13 21:00:56
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九字江山

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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9楼: Originally posted by flll2014 at 2015-03-13 21:00:56
你是重新构建的载体再做的吗？我是第一次做表达时就把质粒提出来了，质粒和菌种都保存的，现在应该重新转化下就可以了吧。你重新做后效果好了吗...

是啊，重组后就成功了。祝你好运
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10楼2015-03-16 09:05:22
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