24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 2090  |  回复: 18

flll2014

铜虫 (小有名气)

[交流] 蛋白表达纯化问题 已有5人参与

去年做的原核表达,成功构建了表达菌株,诱导表达量很高,纯化效果也较好,就保了菌种,今年直接将菌种活化了,也做pcr鉴定了,再诱导表达怎么表达量变得很低,不知道为什么,而且纯化也没纯化出来,请大家帮帮忙,谢谢!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pennchem

专家顾问 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
重新转质粒,挑选单克隆,从头再做一遍表达纯化
行至水穷处,坐看云起时
2楼2015-03-12 14:31:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lomis

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菌株退化了,可涂抗性版挑几个单克隆再表达,如都较低,再重新构建载体转化。
没有命运,只有选择!
3楼2015-03-12 15:14:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lomis at 2015-03-12 15:14:37
菌株退化了,可涂抗性版挑几个单克隆再表达,如都较低,再重新构建载体转化。

原先构建的载体质粒也保存了,重新转化会不会好些
4楼2015-03-12 16:20:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2015-03-12 14:31:46
重新转质粒,挑选单克隆,从头再做一遍表达纯化

好的,谢谢
5楼2015-03-12 16:21:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

九字江山

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你的保种菌是什么菌?以前我做蛋白表达纯化时也曾出现类似问题:原来是可溶表达,保存后活化再表达却是包涵体。给你以下几个意见:
1. 你酶切鉴定的质粒是你未表达的菌液里提出的吗?
2. 你可以再次划板,挑取阳性克隆多个鉴定后做表达试验。
3. 分析你这次的表达条件是否有所不同。
6楼2015-03-13 15:44:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-13 15:44:31
你的保种菌是什么菌?以前我做蛋白表达纯化时也曾出现类似问题:原来是可溶表达,保存后活化再表达却是包涵体。给你以下几个意见:
1. 你酶切鉴定的质粒是你未表达的菌液里提出的吗?
2. 你可以再次划板,挑取阳性 ...

我保的是BL21,我也发现和你类似的结果,活化的菌表达蛋白做可溶性分析,上清中的含量降低了很多。我是从未表达的菌液中抽提的质粒,现在做转化了,不知道后面表达怎么样,再次划板还是划我保的菌液吗?挑取多个克隆若鉴定都是阳性的话都要逐个进行表达实验的吗,谢谢
7楼2015-03-13 16:55:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

九字江山

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by flll2014 at 2015-03-13 16:55:03
我保的是BL21,我也发现和你类似的结果,活化的菌表达蛋白做可溶性分析,上清中的含量降低了很多。我是从未表达的菌液中抽提的质粒,现在做转化了,不知道后面表达怎么样,再次划板还是划我保的菌液吗?挑取多个克 ...

BL21(DE3)或BL21不适合作保种用,是表达用菌,容易出现质粒丢失的情况。先试试转化后的吧,当初我是重新做的。。。
8楼2015-03-13 17:20:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-13 17:20:23
BL21(DE3)或BL21不适合作保种用,是表达用菌,容易出现质粒丢失的情况。先试试转化后的吧,当初我是重新做的。。。...

你是重新构建的载体再做的吗?我是第一次做表达时就把质粒提出来了,质粒和菌种都保存的,现在应该重新转化下就可以了吧。你重新做后效果好了吗
9楼2015-03-13 21:00:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

九字江山

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by flll2014 at 2015-03-13 21:00:56
你是重新构建的载体再做的吗?我是第一次做表达时就把质粒提出来了,质粒和菌种都保存的,现在应该重新转化下就可以了吧。你重新做后效果好了吗...

是啊,重组后就成功了。祝你好运
10楼2015-03-16 09:05:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 flll2014 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 291求调剂 +3 关忆北. 2026-04-09 4/200 2026-04-09 10:22 by wp06
[考研] 化学工程与技术专业一志愿哈工程 291分B区 国家级大创负责人 有一作论文 +4 Emmy~ 2026-04-09 4/200 2026-04-09 10:15 by 鲻鱼的鱼
[考研] 一志愿0807 数一英一 313 有没有二轮调剂 +11 emokidd 2026-04-08 12/600 2026-04-09 09:24 by wyf236
[考研] 材料考研求调剂总分280 +30 mkjlz1 2026-04-06 35/1750 2026-04-08 21:25 by cyh—315
[考研] 机械工程313分找工科调剂 +3 双一流本科机械 2026-04-08 3/150 2026-04-08 20:41 by 土木硕士招生
[考研] 288环境专硕,求调材料方向 +35 lllllos 2026-04-04 39/1950 2026-04-07 23:24 by 一只好果子?
[考研] 259求调剂 +5 就爱吃土豆呀呀 2026-04-07 5/250 2026-04-07 22:40 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂(085602,过四级,一志愿985) +25 化工人999 2026-04-04 26/1300 2026-04-07 22:06 by hemengdong
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +6 崔wj 2026-04-02 6/300 2026-04-07 18:45 by 求调剂zz
[考研] 306求调剂 +3 15287505595 2026-04-03 3/150 2026-04-07 18:08 by 蓝云思雨
[考研] 求调剂 +5 小沢 2026-04-03 5/250 2026-04-06 22:45 by 875465
[考研] 材料专硕322 +11 哈哈哈吼吼吼哈 2026-04-05 11/550 2026-04-06 14:07 by lqwchd
[考研] 346分的生物与医药08600求调剂 +6 常雨阳上岸 2026-04-05 7/350 2026-04-06 12:36 by lys0704
[考研] 求调剂,一志愿郑州大学材料与化工专硕,英二数二342分,求老师收留 +19 v12abo 2026-04-02 21/1050 2026-04-06 09:29 by 蓝云思雨
[考研] 070300化学学硕311分求调剂 +11 梁富贵险中求 2026-04-04 13/650 2026-04-06 07:24 by houyaoxu
[考研] 材料与化工371求调剂 +14 陪琳看海 2026-04-04 15/750 2026-04-06 06:59 by houyaoxu
[考研] 301求调剂 +3 XYPLR 2026-04-05 4/200 2026-04-05 19:07 by XYPLR
[考研] 277求调剂 +5 考研调剂lxh 2026-04-05 5/250 2026-04-05 19:03 by chy09050039
[考研] 材料调剂 +9 革微桂 2026-04-04 9/450 2026-04-05 08:27 by 544594351
[考研] 本科985,专业0812分336求调剂 +4 莫莫很行 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:31 by zhq0425
信息提示
请填处理意见