24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 2096  |  回复: 18

flll2014

铜虫 (小有名气)

[交流] 蛋白表达纯化问题 已有5人参与

去年做的原核表达,成功构建了表达菌株,诱导表达量很高,纯化效果也较好,就保了菌种,今年直接将菌种活化了,也做pcr鉴定了,再诱导表达怎么表达量变得很低,不知道为什么,而且纯化也没纯化出来,请大家帮帮忙,谢谢!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pennchem

专家顾问 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
重新转质粒,挑选单克隆,从头再做一遍表达纯化
行至水穷处,坐看云起时
2楼2015-03-12 14:31:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lomis

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
菌株退化了,可涂抗性版挑几个单克隆再表达,如都较低,再重新构建载体转化。
没有命运,只有选择!
3楼2015-03-12 15:14:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lomis at 2015-03-12 15:14:37
菌株退化了,可涂抗性版挑几个单克隆再表达,如都较低,再重新构建载体转化。

原先构建的载体质粒也保存了,重新转化会不会好些
4楼2015-03-12 16:20:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2015-03-12 14:31:46
重新转质粒,挑选单克隆,从头再做一遍表达纯化

好的,谢谢
5楼2015-03-12 16:21:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

九字江山

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你的保种菌是什么菌?以前我做蛋白表达纯化时也曾出现类似问题:原来是可溶表达,保存后活化再表达却是包涵体。给你以下几个意见:
1. 你酶切鉴定的质粒是你未表达的菌液里提出的吗?
2. 你可以再次划板,挑取阳性克隆多个鉴定后做表达试验。
3. 分析你这次的表达条件是否有所不同。
6楼2015-03-13 15:44:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-13 15:44:31
你的保种菌是什么菌?以前我做蛋白表达纯化时也曾出现类似问题:原来是可溶表达,保存后活化再表达却是包涵体。给你以下几个意见:
1. 你酶切鉴定的质粒是你未表达的菌液里提出的吗?
2. 你可以再次划板,挑取阳性 ...

我保的是BL21,我也发现和你类似的结果,活化的菌表达蛋白做可溶性分析,上清中的含量降低了很多。我是从未表达的菌液中抽提的质粒,现在做转化了,不知道后面表达怎么样,再次划板还是划我保的菌液吗?挑取多个克隆若鉴定都是阳性的话都要逐个进行表达实验的吗,谢谢
7楼2015-03-13 16:55:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

九字江山

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by flll2014 at 2015-03-13 16:55:03
我保的是BL21,我也发现和你类似的结果,活化的菌表达蛋白做可溶性分析,上清中的含量降低了很多。我是从未表达的菌液中抽提的质粒,现在做转化了,不知道后面表达怎么样,再次划板还是划我保的菌液吗?挑取多个克 ...

BL21(DE3)或BL21不适合作保种用,是表达用菌,容易出现质粒丢失的情况。先试试转化后的吧,当初我是重新做的。。。
8楼2015-03-13 17:20:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

flll2014

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 九字江山 at 2015-03-13 17:20:23
BL21(DE3)或BL21不适合作保种用,是表达用菌,容易出现质粒丢失的情况。先试试转化后的吧,当初我是重新做的。。。...

你是重新构建的载体再做的吗?我是第一次做表达时就把质粒提出来了,质粒和菌种都保存的,现在应该重新转化下就可以了吧。你重新做后效果好了吗
9楼2015-03-13 21:00:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

九字江山

银虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by flll2014 at 2015-03-13 21:00:56
你是重新构建的载体再做的吗?我是第一次做表达时就把质粒提出来了,质粒和菌种都保存的,现在应该重新转化下就可以了吧。你重新做后效果好了吗...

是啊,重组后就成功了。祝你好运
10楼2015-03-16 09:05:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 flll2014 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 083200 初试305分 求调剂 +11 Claireyyyy 2026-04-09 11/550 2026-04-09 13:19 by 诗与自由
[考研] 材料299专硕求调剂 +7 +21 2026-04-09 7/350 2026-04-09 13:10 by yutian743
[考研] 初试分332,一志愿报考西北工业大学, +4 故人?? 2026-04-09 4/200 2026-04-09 13:01 by 帕尔马拉特
[考研] 一志愿0807 数一英一 313 有没有二轮调剂 +11 emokidd 2026-04-08 12/600 2026-04-09 09:24 by wyf236
[考研] 考研调剂 +12 冰冰,,, 2026-04-07 12/600 2026-04-09 09:04 by 5268321
[考研] 302分求调剂 +4 凡语祈愿 2026-04-08 5/250 2026-04-08 22:03 by 土木硕士招生
[考研] 本科211,293分请求调剂 +12 莲菜就是藕吧 2026-04-03 13/650 2026-04-08 20:30 by 背对大海出发
[考研] 一志愿华南师范大学-22408计算机-292分-求华南师范大学调剂 +5 爱读书的小鳄鱼 2026-04-02 5/250 2026-04-08 14:55 by CAS小花工
[考研] 280求调剂 +9 李rien 2026-04-04 9/450 2026-04-08 13:20 by lijunpoly
[考研] 材料调剂 +11 一样YWY 2026-04-07 11/550 2026-04-07 15:13 by shdgaomin
[考研] 求调剂 +5 小沢 2026-04-03 5/250 2026-04-06 22:45 by 875465
[考研] 327考研调剂推荐 +6 呜呜呜呜呢 2026-04-06 6/300 2026-04-06 21:39 by 啵啵啵0119
[考研] 304求调剂 +4 luoye0105 2026-04-05 4/200 2026-04-06 21:05 by 木子君1218
[考研] 08专硕275调剂 +5 AaAa7420 2026-04-05 5/250 2026-04-05 18:01 by jkddd
[考研] 男生,一志愿沪9生物学071000,初试308求调剂 +3 刘墨墨 2026-04-04 3/150 2026-04-05 08:26 by barlinike
[考研] 0835学硕299求调剂 08大类可接受 +5 useryy 2026-04-03 5/250 2026-04-04 20:07 by 蓝云思雨
[考研] 考研调剂 +4 zybz冲冲冲 2026-04-03 6/300 2026-04-04 13:08 by zybz冲冲冲
[考研] 278求调剂 +6 Yy7400 2026-04-03 6/300 2026-04-04 09:53 by zhangdingwa
[考研] 315求调剂 +6 顺理成张 2026-04-03 8/400 2026-04-03 14:04 by 百灵童888
[考研] 366求调剂 +7 sbdnd 2026-04-03 7/350 2026-04-03 12:40 by cymywx
信息提示
请填处理意见