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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 简并引物PCR求助
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

[求助] 简并引物PCR求助 已有1人参与

刚刚跑完胶，结果很不好，只能来求助了。
用设计了几对简并引物，开始用降落PCR没有产物，后来就把退火温度降到46度，加4%DMSO,增加镁离子浓度至1.2mM，第一对引物出现了400-2000附近多条杂带(预期1000bp)，如图1，marker旁边是空白，居然也有亮带。。。

尝试用第2~4对引物(在第一对之内)进行巢式PCR，结果没条带，还出现了从点样孔到前沿的亮带，如图2，全部都是亮带。。。

我这样用巢式PCR对不对呢，新手入门，求指点问题所在，以及后续办法。
简并引物PCR求助
2   .jpg


简并引物PCR求助-1
1   .jpg
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1楼 2015-02-03 00:06:48
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
顺序乱了，将就。。。
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2楼2015-02-03 00:15:54
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maila
3楼2015-02-03 07:38:19
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Ivy尘: 金币+12 2015-02-03 10:34:59
既然巢式PCR之后出现了拖带而且跑的那么。。。说明方法不对啊。看你这两张图，完全没跑出结果啊。。。。
设计好引物之后，正常PCR啊，为什么一开始就要用降落PCR呢？进行各试剂浓度，温度的摸索是正确的，但应该在一两次PCR没有结果的时候再尝试啊。从marker来看，胶的质量（浓度）也有问题，原因应该从各方面分析
模板：模板是什么，多少bp，反应终浓度多少呢？
引物：两张图都说明了，引物要不就没问题，要不就是有大问题，特异性太差，完全没条带，都是拖尾
扩增试剂：扩增的酶（保真酶，热启动酶热启动酶，普通酶）镁离子 DMSO 可以使用专门的不用额外加进去的buffer，这样就省略了对这两者还要进行浓度优化。还有反应条件（温度，时间）
个人认为全部都要再考虑一遍
好运
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-02-03 09:29:17
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
Ivy尘: 金币+8, ★★★很有帮助 2015-02-03 10:34:50
空白对照出现亮带，原因：① 实验中操作导致交叉污染
② 试剂本身受到污染
赞一下(1人) 回复此楼
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
5楼2015-02-03 09:32:03
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-02-03 09:32:03
空白对照出现亮带，原因：① 实验中操作导致交叉污染
② 试剂本身受到污染

谢谢！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2015-02-03 10:26:57
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Ivy尘

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-02-03 09:29:17
既然巢式PCR之后出现了拖带而且跑的那么。。。说明方法不对啊。看你这两张图，完全没跑出结果啊。。。。
设计好引物之后，正常PCR啊，为什么一开始就要用降落PCR呢？进行各试剂浓度，温度的摸索是正确的，但应该在 ...

多谢！我是才开始做分子……看书上说不确定退火温度时就用降落PCR,可以排除非特异性产物，一次不成功之后，我就降低了退火温度，尝试了50、46度，有许多杂带，所以想接着做巢式是不是可以p出特异的那一条，看来是不行啊……今天之前都没有出现过如此大范围的拖尾，所以一时不知怎么回事……希望不是酶和buffer受污染……简并引物有两对是参照文献的，不过植物来源不同，另外自己根据保守区域设计了三对，感觉我设计的更保守一些呢，可惜全都没扩出来

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2015-02-03 10:34:28
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