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Ivy尘

新虫 (正式写手)

[求助] 简并引物PCR求助已有1人参与

刚刚跑完胶,结果很不好,只能来求助了。
用设计了几对简并引物,开始用降落PCR没有产物,后来就把退火温度降到46度,加4%DMSO,增加镁离子浓度至1.2mM,第一对引物出现了400-2000附近多条杂带(预期1000bp),如图1,marker旁边是空白,居然也有亮带。。。

尝试用第2~4对引物(在第一对之内)进行巢式PCR,结果没条带,还出现了从点样孔到前沿的亮带,如图2,全部都是亮带。。。

我这样用巢式PCR对不对呢,新手入门,求指点问题所在,以及后续办法。
简并引物PCR求助
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简并引物PCR求助-1
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

顺序乱了,将就。。。
2楼2015-02-03 00:15:54
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3楼2015-02-03 07:38:19
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Ivy尘: 金币+12 2015-02-03 10:34:59
既然巢式PCR之后出现了拖带而且跑的那么。。。说明方法不对啊。看你这两张图,完全没跑出结果啊。。。。
设计好引物之后,正常PCR啊,为什么一开始就要用降落PCR呢?进行各试剂浓度,温度的摸索是正确的,但应该在一两次PCR没有结果的时候再尝试啊。从marker来看,胶的质量(浓度)也有问题,原因应该从各方面分析
模板:模板是什么,多少bp,反应终浓度多少呢?
引物:两张图都说明了,引物要不就没问题,要不就是有大问题,特异性太差,完全没条带,都是拖尾
扩增试剂:扩增的酶(保真酶,热启动酶热启动酶,普通酶)镁离子 DMSO 可以使用专门的不用额外加进去的buffer,这样就省略了对这两者还要进行浓度优化。还有反应条件(温度,时间)
个人认为全部都要再考虑一遍
好运
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-02-03 09:29:17
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
Ivy尘: 金币+8, ★★★很有帮助 2015-02-03 10:34:50
空白对照出现亮带,原因:① 实验中操作导致交叉污染
② 试剂本身受到污染
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
5楼2015-02-03 09:32:03
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-02-03 09:32:03
空白对照出现亮带,原因:① 实验中操作导致交叉污染
② 试剂本身受到污染

谢谢!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
6楼2015-02-03 10:26:57
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Ivy尘

新虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-02-03 09:29:17
既然巢式PCR之后出现了拖带而且跑的那么。。。说明方法不对啊。看你这两张图,完全没跑出结果啊。。。。
设计好引物之后,正常PCR啊,为什么一开始就要用降落PCR呢?进行各试剂浓度,温度的摸索是正确的,但应该在 ...

多谢!我是才开始做分子……看书上说不确定退火温度时就用降落PCR,可以排除非特异性产物,一次不成功之后,我就降低了退火温度,尝试了50、46度,有许多杂带,所以想接着做巢式是不是可以p出特异的那一条,看来是不行啊……今天之前都没有出现过如此大范围的拖尾,所以一时不知怎么回事……希望不是酶和buffer受污染……简并引物有两对是参照文献的,不过植物来源不同,另外自己根据保守区域设计了三对,感觉我设计的更保守一些呢,可惜全都没扩出来

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
7楼2015-02-03 10:34:28
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