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Ivy尘

新虫 (正式写手)

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[求助] 简并引物PCR求助已有1人参与

刚刚跑完胶，结果很不好，只能来求助了。
用设计了几对简并引物，开始用降落PCR没有产物，后来就把退火温度降到46度，加4%DMSO,增加镁离子浓度至1.2mM，第一对引物出现了400-2000附近多条杂带(预期1000bp)，如图1，marker旁边是空白，居然也有亮带。。。

尝试用第2~4对引物(在第一对之内)进行巢式PCR，结果没条带，还出现了从点样孔到前沿的亮带，如图2，全部都是亮带。。。

我这样用巢式PCR对不对呢，新手入门，求指点问题所在，以及后续办法。

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1楼2015-02-03 00:06:48

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木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

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Ivy尘: 金币+12 2015-02-03 10:34:59

既然巢式PCR之后出现了拖带而且跑的那么。。。说明方法不对啊。看你这两张图，完全没跑出结果啊。。。。
设计好引物之后，正常PCR啊，为什么一开始就要用降落PCR呢？进行各试剂浓度，温度的摸索是正确的，但应该在一两次PCR没有结果的时候再尝试啊。从marker来看，胶的质量（浓度）也有问题，原因应该从各方面分析
模板：模板是什么，多少bp，反应终浓度多少呢？
引物：两张图都说明了，引物要不就没问题，要不就是有大问题，特异性太差，完全没条带，都是拖尾
扩增试剂：扩增的酶（保真酶，热启动酶热启动酶，普通酶）镁离子 DMSO 可以使用专门的不用额外加进去的buffer，这样就省略了对这两者还要进行浓度优化。还有反应条件（温度，时间）
个人认为全部都要再考虑一遍
好运