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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 为什么普通PCR后，电泳条带清晰，定量PCR却总是不出结果？
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utyutyy

新虫 (小有名气)

[求助] 为什么普通PCR后，电泳条带清晰，定量PCR却总是不出结果？ 已有5人参与

最近在做miRNA的定量检测，用定量引物先做的普通PCR检测，以及退火温度摸条件，条带都很清晰。但是做了好几次qRT-PCR，Ct值都在40以上，内参U6的结果很正常。

难道同样的引物在普通PCR和qRT-PCR效果会不同么？？？
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1楼 2015-01-19 12:50:14
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
扩增片段多长？可以先做个半定量试试看。
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2楼2015-01-19 12:53:49
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utyutyy

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-19 12:53:49
扩增片段多长？可以先做个半定量试试看。

miRNA反转录出来一般都在80-100bp左右。师兄师姐以及同届其他人做这步试验时（也是miRNA），都能出结果。
而且我现在做的还是转染mimics后，验证转染后确实可以提高细胞内miRNA含量。转染我挺有信心的，之前做双荧光检测，都很顺利，而且这次我已经转染两次了。。。
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3楼2015-01-19 13:06:53
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muyouleya

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
utyutyy(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-02 19:43:24
1.普通PCR的条带确定不是引物二聚体？
2.做RT PCR的模板与普通PCR的模板是同一管的样本？
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4楼2015-02-27 20:17:10
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happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
utyutyy(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-02 19:43:43
荧光定量优化不能靠普通PCR来做
1 是确定你的模板没有问题
2 是多选几条引物看看
3 是荧光定量的程序优化一下
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5楼2015-02-28 08:48:05
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引物探针特异性不好也有可能的。。。
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采菊东篱下，悠然见南山。
6楼2015-02-28 09:54:49
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A913162220

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

qRT-PCR的荧光染料不合适吧，我们用的SYBR Green啊
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7楼2015-03-01 17:31:19
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仙人掌君

新虫 (初入文坛)
请问楼主后来找到原因了吗？最近做实验也遇到了同样的问题，着急
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8楼2018-01-05 13:23:18
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