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克隆测序结果分析，急急已有3人参与
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| 刚开始做PCR和克隆，要测功能基因，目的条带大概300，用纯菌做的，直接送PCR产物测序，测出来结果是目的基因，然后老师让克隆，不知为什么，老师没让纯化，直接没切条带直接做了克隆，做完送去测序，是用PCR引物测得，结果出来估计不好，因为我还不知道怎么看克隆测序结果，然后老师又让用载体引物送去测序，现在结果出来了，我想问下这个实验中间是不是有什么不妥，会造成结果不对，还有就是测序结果到底怎么看？用PCR引物测序和用载体引物测序，结果究竟有什么不同？怎么分析能看出来是不是有我要的目的基因？求解答啊（我金币太少啦，全部都用上啦） |
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2楼2014-12-19 20:36:26
hajierlove
铜虫 (正式写手)
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3楼2014-12-19 20:36:26
guoliwang
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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质粒克隆用PCR引物测序是错误的。第一，PCR片段全部序列必须测通，否则也许会漏掉随机突变，如果用引物PCR，至少引物和随后的十几个碱基是测不准的。第二，PCR片段插入有时会发生倒插现象，这个必须用载体引物才看得出来。 “不知为什么，老师没让纯化，直接没切条带直接做了克隆”是部分PCR产物电泳后纯化测序正确，所以老师让你拿剩余的PCR产物直接连载体了么？这样是可以的。因为电泳纯化会损失一部分PCR产物。这样直接连成功率更高。而PCR反应体系中的引物和模板DNA不会参与连接的。 测序结果中不同颜色的峰分别代表ATCG，按顺序读就好，其实在每个峰的上部都有标明ATCG的，自己最好从头至尾读一遍，有的时候重叠峰或峰值低，机器容易误读。PCR产物的序列应该是已知的吧，可以去NCBI的blast和测序结果做比对。 |
4楼2014-12-19 21:35:20