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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 关于双酶切后连接转化，酶切验证切不开。已有3人参与

各位虫友，大家好，我的目的基因是1119bp，连接体系应该是没问题的，我们实验室用的都是25微升的体系。
第一次我做了EcoRI和XhoI酶切位点：
该做的对照我都做了，但是实验失败，最后得出的结论是以下原因：
1、基因没有加上酶切位点导致我没切开，连不上。2、我的连接酶失效了不好使。
连接酶不好使的可能性很小。
但是我想换一下酶，所以做了第二次试验：
第二次换了酶切位点以后我选择的是EcoRI和SalI这两个酶，目的基因PCR条带没问题，做过单酶切，也都没问题，但是菌液PCR有条带，质粒PCR后没有条带，也就是说我还是没连上，那我分析了一下，不应该这么凑巧是酶的问题，是否是我设计的引物出现问题，例如这段引物就是对酶切位点有影响导致切不开，所以想换引物。但是这段序列很特别，引物也是好不容易找的，所以不到万不得已我是不想换引物的，各位虫友有什么好的建议么？
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1楼2014-12-01 09:58:27
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-01 10:52:59
“目的基因PCR条带没问题，做过单酶切，也都没问题”你是怎么看的单酶切没问题？PCR产物做的酶切？建议你可以把产物连接到T载体或平末端载体测个序看看酶切位点有没有问题。
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hehe
2楼2014-12-01 10:20:20
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linxiaolin08

捐助贵宾 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-12-01 10:20:20
“目的基因PCR条带没问题，做过单酶切，也都没问题”你是怎么看的单酶切没问题？PCR产物做的酶切？建议你可以把产物连接到T载体或平末端载体测个序看看酶切位点有没有问题。

是用质粒做了单酶切验证，都切开了，所以证明酶没问题。
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3楼2014-12-01 10:48:27
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-12-01 16:21:16
尝试着用TAQ酶扩增之后连入T载体之后再进行酶切
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学习再学习，努力再努力。
4楼2014-12-01 15:49:44
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yesucao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-01 16:21:20
直接去测序看看，是不是真的没有连上，我有一次就碰到这样的情况，单酶切插入的目的条带，PCR验证有条带，就拿去测序了，测序结果出来后发现有一端的酶切位点不知道为什么没有了，但另一段的酶切位点还在。
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5楼2014-12-01 15:58:33
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zzhjiangnan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yesucao at 2014-12-01 15:58:33
直接去测序看看，是不是真的没有连上，我有一次就碰到这样的情况，单酶切插入的目的条带，PCR验证有条带，就拿去测序了，测序结果出来后发现有一端的酶切位点不知道为什么没有了，但另一段的酶切位点还在。

大神我也遇到这种情况了，卡了好久了，跪求指点。
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6楼2014-12-25 20:24:34
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6491333

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yesucao at 2014-12-01 15:58:33
直接去测序看看，是不是真的没有连上，我有一次就碰到这样的情况，单酶切插入的目的条带，PCR验证有条带，就拿去测序了，测序结果出来后发现有一端的酶切位点不知道为什么没有了，但另一段的酶切位点还在。

求指导

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怪我咯|本人是用生命唱歌的歌手一名!
7楼2017-06-26 09:17:20
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