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linxiaolin08捐助贵宾 (初入文坛)
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关于双酶切后连接转化，酶切验证切不开。 已有3人参与
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各位虫友，大家好，我的目的基因是1119bp，连接体系应该是没问题的，我们实验室用的都是25微升的体系。 第一次我做了EcoRI和XhoI酶切位点： 该做的对照我都做了，但是实验失败，最后得出的结论是以下原因： 1、基因没有加上酶切位点导致我没切开，连不上。2、我的连接酶失效了不好使。 连接酶不好使的可能性很小。 但是我想换一下酶，所以做了第二次试验： 第二次换了酶切位点以后我选择的是EcoRI和SalI这两个酶，目的基因PCR条带没问题，做过单酶切，也都没问题，但是菌液PCR有条带，质粒PCR后没有条带，也就是说我还是没连上，那我分析了一下，不应该这么凑巧是酶的问题，是否是我设计的引物出现问题，例如这段引物就是对酶切位点有影响导致切不开，所以想换引物。但是这段序列很特别，引物也是好不容易找的，所以不到万不得已我是不想换引物的，各位虫友有什么好的建议么？ |
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