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liuwukang

新虫 (小有名气)

[求助] 关于凝胶回收浓度以及质粒抽提的浓度问题 已有5人参与

本人刚刚研一,做微生物的基因敲除,现在处在构建电转化的载体阶段,想请教两个问题:
1、pcr之后条带很亮而且做了好几管,但是回收的浓度总是上不来,一直在80到100ng/μL左右,因为后期需要酶切,这个浓度稍微有些低,用的是天根的试剂盒,是操作的问题吗?有没有什么改进的方法,有经验的师兄师姐们给点建议
2、质粒抽提时,浓度时高时低,养菌的时间一般也都差不多,这是怎么回事呢?
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wxlzl0915

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

如果后期需做酶切,建议用水代替elution buffer,30~50uL,加30ul即可
莫愁前路无知己,天下谁人不识君。
9楼2014-11-26 11:34:46
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普通回帖

飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuwukang(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-23 13:20:41
那个试剂盒我用过,你这样,酒精洗完干燥5min,然后加入elution buffer以后再盖盖溶解5min然后离心即可!
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
2楼2014-11-23 10:32:14
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liuwukang

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-11-23 10:32:14
那个试剂盒我用过,你这样,酒精洗完干燥5min,然后加入elution buffer以后再盖盖溶解5min然后离心即可!

嗯,今天打算多干燥一会再洗,另问,洗脱用50uL可以吗?多了还是少了?
3楼2014-11-23 12:04:39
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这个浓度足以你做n次连接的。继续往下看

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2014-11-23 12:40:47
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liuwukang

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by myheat at 2014-11-23 12:40:47
这个浓度足以你做n次连接的。继续往下看

请问做连接时一般多少的浓度是最低限?
5楼2014-11-23 21:21:37
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖


liuwukang(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:02:35
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuwukang at 2014-11-23 21:21:37
请问做连接时一般多少的浓度是最低限?...

我用过最低的有30-40都可以的

[ 发自小木虫客户端 ]
人生贵在行动,迟疑不决时,不妨先迈出小小一步。
6楼2014-11-24 07:46:27
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by liuwukang at 2014-11-23 21:21:37
请问做连接时一般多少的浓度是最低限?...

总量够就行。浓度无要求,所有步骤用水代替kit里面的EB

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-11-24 08:41:47
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
liuwukang(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:02:45
如果觉得胶回收浓度低的话,可以多备些样品,多切几块
8楼2014-11-24 13:12:34
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liuwukang

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by wxlzl0915 at 2014-11-26 11:34:46
如果后期需做酶切,建议用水代替elution buffer,30~50uL,加30ul即可

现在酶切效果还可以,主要考虑连接的问题,为什么用水呢?有什么区别?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
10楼2014-11-26 18:20:40
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