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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 关于凝胶回收浓度以及质粒抽提的浓度问题
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liuwukang

新虫 (小有名气)

[求助] 关于凝胶回收浓度以及质粒抽提的浓度问题 已有5人参与

本人刚刚研一，做微生物的基因敲除，现在处在构建电转化的载体阶段，想请教两个问题：
1、pcr之后条带很亮而且做了好几管，但是回收的浓度总是上不来，一直在80到100ng/μL左右，因为后期需要酶切，这个浓度稍微有些低，用的是天根的试剂盒，是操作的问题吗？有没有什么改进的方法，有经验的师兄师姐们给点建议
2、质粒抽提时，浓度时高时低，养菌的时间一般也都差不多，这是怎么回事呢？
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1楼 2014-11-22 22:42:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wxlzl0915

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

如果后期需做酶切，建议用水代替elution buffer，30~50uL，加30ul即可
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莫愁前路无知己，天下谁人不识君。
9楼2014-11-26 11:34:46
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普通回帖

飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuwukang(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-23 13:20:41
那个试剂盒我用过，你这样，酒精洗完干燥5min，然后加入elution buffer以后再盖盖溶解5min然后离心即可！
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
2楼2014-11-23 10:32:14
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liuwukang

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2014-11-23 10:32:14
那个试剂盒我用过，你这样，酒精洗完干燥5min，然后加入elution buffer以后再盖盖溶解5min然后离心即可！

嗯，今天打算多干燥一会再洗，另问，洗脱用50uL可以吗？多了还是少了？
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3楼2014-11-23 12:04:39
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个浓度足以你做n次连接的。继续往下看

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4楼2014-11-23 12:40:47
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liuwukang

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by myheat at 2014-11-23 12:40:47
这个浓度足以你做n次连接的。继续往下看

请问做连接时一般多少的浓度是最低限？
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5楼2014-11-23 21:21:37
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★
liuwukang(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:02:35
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuwukang at 2014-11-23 21:21:37
请问做连接时一般多少的浓度是最低限？...

我用过最低的有30-40都可以的

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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
6楼2014-11-24 07:46:27
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by liuwukang at 2014-11-23 21:21:37
请问做连接时一般多少的浓度是最低限？...

总量够就行。浓度无要求，所有步骤用水代替kit里面的EB

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2014-11-24 08:41:47
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korchagin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
liuwukang(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-24 19:02:45
如果觉得胶回收浓度低的话，可以多备些样品，多切几块
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8楼2014-11-24 13:12:34
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liuwukang

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wxlzl0915 at 2014-11-26 11:34:46
如果后期需做酶切，建议用水代替elution buffer，30~50uL，加30ul即可

现在酶切效果还可以，主要考虑连接的问题，为什么用水呢？有什么区别？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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10楼2014-11-26 18:20:40
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