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dongyan08

木虫 (正式写手)

[求助] pPICZαC质粒抽提浓度低

请问pPICZαC质粒是低拷贝还是高拷贝质粒?我抽了三次质粒浓度都比较低,在0.5-1.0ug/ml,用质粒转了下转化,挑了克隆,重新抽提还是比较低,抽其他的都抽得挺好的,3ug/ml以上,所以想问下什么原因抽的浓度那么低呢?会不会是它拷贝低,我摇菌时间8个小时,导致抽不高浓度呢?麻烦有关经验的指导指导,谢谢!

[ Last edited by dongyan08 on 2013-7-16 at 21:26 ]
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肃清华书

金虫 (小有名气)

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dongyan08(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-19 00:34:11
8个小时可能有点短,12h去试试,如果浓度低很可能是低拷贝的,一般来做可以用PCR来扩增,反正你要得到的是质粒。。
2楼2013-07-16 22:06:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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dongyan08(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-19 00:34:27
这个质粒应该是高拷贝的吧。我奇怪的是LZ的质粒浓度,一般mini-prep提质粒的浓度不是几百μg/ml的吗?如果大提,浓度可以到几μg/μl。
3楼2013-07-17 03:55:00
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dongyan08

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-17 03:55:00
这个质粒应该是高拷贝的吧。我奇怪的是LZ的质粒浓度,一般mini-prep提质粒的浓度不是几百μg/ml的吗?如果大提,浓度可以到几μg/μl。

是啊,我也奇怪,半年前提还是很正常的,现在提浓度就总是那么低!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2013-07-17 07:51:40
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xuyihui2001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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dongyan08(gyesang代发): 金币+2, 鼓励应助! 2013-07-19 00:34:35
建议你测个序,也许基因突变了!因为大肠杆菌中的质粒片段有时候会被附近的Amp等的启动子启动,少量表达,这样如果该片段对大肠杆菌有毒,就可能导致质粒拷贝数低!也就是说,你之前没有拷贝数第的原因,之后又有,那么从这方面的思路看来,可能是多次传代导致突变了。一般扩增质粒用JM109,或TOP10,质粒保守性强些。
5楼2013-07-17 08:02:44
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dongyan08

木虫 (正式写手)

抗生素用了应该有2年了,会不会是抗生素失效的原因呢?
6楼2013-07-17 09:07:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by dongyan08 at 2013-07-17 07:51:40
是啊,我也奇怪,半年前提还是很正常的,现在提浓度就总是那么低!
...

你检查一下抗生素是否失效,用空抗性板涂少量无该抗性的菌看看。如果不是抗生素的问题,可能是菌种退化了。最好从-80°C冰箱里的保种重新活化。
7楼2013-07-17 09:38:45
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