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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pPICZαC质粒抽提浓度低
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dongyan08

木虫 (正式写手)

[求助] pPICZαC质粒抽提浓度低

请问pPICZαC质粒是低拷贝还是高拷贝质粒？我抽了三次质粒浓度都比较低，在0.5-1.0ug/ml，用质粒转了下转化，挑了克隆，重新抽提还是比较低，抽其他的都抽得挺好的，3ug/ml以上，所以想问下什么原因抽的浓度那么低呢？会不会是它拷贝低，我摇菌时间8个小时，导致抽不高浓度呢？麻烦有关经验的指导指导，谢谢！

[ Last edited by dongyan08 on 2013-7-16 at 21:26 ]
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1楼 2013-07-16 20:22:30
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肃清华书

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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dongyan08(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-19 00:34:11
8个小时可能有点短，12h去试试，如果浓度低很可能是低拷贝的，一般来做可以用PCR来扩增，反正你要得到的是质粒。。
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2楼2013-07-16 22:06:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dongyan08(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-19 00:34:27
这个质粒应该是高拷贝的吧。我奇怪的是LZ的质粒浓度，一般mini-prep提质粒的浓度不是几百μg/ml的吗？如果大提，浓度可以到几μg/μl。
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3楼2013-07-17 03:55:00
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dongyan08

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-17 03:55:00
这个质粒应该是高拷贝的吧。我奇怪的是LZ的质粒浓度，一般mini-prep提质粒的浓度不是几百μg/ml的吗？如果大提，浓度可以到几μg/μl。

是啊，我也奇怪，半年前提还是很正常的，现在提浓度就总是那么低！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2013-07-17 07:51:40
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xuyihui2001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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dongyan08(gyesang代发): 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-19 00:34:35
建议你测个序，也许基因突变了!因为大肠杆菌中的质粒片段有时候会被附近的Amp等的启动子启动，少量表达，这样如果该片段对大肠杆菌有毒，就可能导致质粒拷贝数低！也就是说，你之前没有拷贝数第的原因，之后又有，那么从这方面的思路看来，可能是多次传代导致突变了。一般扩增质粒用JM109，或TOP10，质粒保守性强些。
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5楼2013-07-17 08:02:44
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dongyan08

木虫 (正式写手)
抗生素用了应该有2年了，会不会是抗生素失效的原因呢？
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6楼2013-07-17 09:07:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by dongyan08 at 2013-07-17 07:51:40
是啊，我也奇怪，半年前提还是很正常的，现在提浓度就总是那么低！
...

你检查一下抗生素是否失效，用空抗性板涂少量无该抗性的菌看看。如果不是抗生素的问题，可能是菌种退化了。最好从-80°C冰箱里的保种重新活化。
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7楼2013-07-17 09:38:45
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