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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高GC含量基因PCR扩增不出条带
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313cr

新虫 (初入文坛)

[求助] 高GC含量基因PCR扩增不出条带 已有9人参与

各位大神们，求助啊，最近在扩一个基因，GC含量含量为55.8%，不过5‘端GC含量太高了，引物不好设计，已经设计了好几对引物都没扩出来，有没有大神能给指点指点啊，基因序列：ATGGCGTCCAACGCCGCGGCTGCGGCGGCGGTGTCCCTGGACCAGGCCGTGGCGGCGTCGGCGGCGTTCTCGTCGCGGAAGCAGCTGCGGCTGCCCGCCGCGGCGCGCGGGGGGATGCGGGTGCGGGTGCGGGCGCGGGGGCGGCGGGAGGCGGTGGTGGTGGCGTCCGCGTCGTCGTCGTCGGTGGCAGCGCCGGCGGCGAAGGCGGAGGAGATCGTGCTCCAGCCCATCAGGGAGATCTCCGGGGCGGTTCAGCTGCCAGGGTCCAAGTCGCTCTCCAACAGGATCCTCCTCCTCTCCGCCCTCTCCGAGGGCACAACAGTGGTGGACAACTTGCTGAACAGTGAGGATGTTCACTACATGCTTGAGGCCCTGAAAGCCCTCGGGCTCTCTGTGGAAGCAGATAAAGTTGCAAAAAGAGCTGTAGTCGTTGGCTGTGGTGGCAAGTTTCCTGTTGAGAAGGATGCGAAAGAGGAAGTGCAACTCTTCTTGGGGAACGCTGGAACTGCAATGCGACCATTGACAGCAGCCGTGACTGCTGCTGGTGGAAATGCAACTTATGTGCTTGATGGAGTGCCACGAATGAGGGAGAGACCGATTGGTGACTTGGTTGTCGGGTTGAAACAACTTGGTGCGGATGTCGACTGTTTCCTTGGCACTGAATGCCCACCTGTTCGTGTCAAGGGAATTGGAGGACTTCCTGGTGGCAAGGTTAAGCTCTCTGGTTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCCCTTGGGGATGTGGAGATCGAAATCATTGACAAACTAATCTCCATTCCTTACGTTGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAGGCAGAGCATTCTGATAGTTGGGACAGATTCTATATTAAGGGAGGGCAGAAGTACAAATCTCCTGGAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCGAGCTATTTCTTGGCTGGTGCTGCAATCACTGGAGGCACTGTGACAGTTCAAGGTTGTGGTACGACCAGTTTGCAGGGTGATGTCAAATTTGCTGAGGTACTTGAGATGATGGGAGCAAAGGTTACATGGACTGACACCAGTGTAACCGTAACTGGTCCACCACGTGAGCCTTATGGGAAGAAACACCTGAAAGCTGTTGATGTCAACATGAACAAAATGCCTGATGTTGCCATGACCCTTGCCGTTGTTGCACTCTTCGCTGATGGTCCAACTGCTATCAGAGATGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAAACCGAAAGGATGGTTGCAATTCGGACCGAGCTAACAAAGCTGGGAGCATCGGTTGAAGAAGGTCCTGACTACTGCATCATCACCCCACCGGAGAAGCTGAACATCACGGCAATCGACACCTACGATGATCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTCGCTGCCTGCGCCGACGTGCCCGTGACGATCAGGGACCCTGGTTGCACCCGCAAGACCTTCCCCAACTACTTCGACGTTCTAAGCACTTTCGTCAGGAACTGA
我是想要扩基因的全长，酶用过宝生物的LA Taq、rTaq酶、HOT star等，都没扩出来，中间有一次用KOD酶扩出来条带过，不过特异性不好，而且第二次一样的条件再扩就又扩不出来了，cDNA是用内参检测过了，别的同学扩其他基因也能扩出来，cDNA应该没问题，实在是不知道怎么弄了。
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1楼 2014-10-11 14:34:37
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

HS_陕西师大

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
313cr(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-15 14:57:05
我通过你提供的序列帮你设计了3对引物，建议你使用GenStar的普通mix先摸索下PCR条件，然后用pfu类得高保真Taq扩增你要的片段F1:GGCGGTGTCCCTGGACCA,R1:TGATCGTCACGGGCACG F2:TGATCGTCACGGGCACG, R2:TCGGCGGCGTTCTCGTC
F3: TCGGCGGCGTTCTCGTC, R3：TGCGGGTGCAACCAGGG，还有建议你使用RACE技术扩增出5‘UTR和3’UTR后在UTR区设计引物。祝你成功。
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For me,the past is black and white,but the future is always color
10楼2014-10-15 09:04:45
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普通回帖

lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-11 19:04:22
我记得在扩GC含量高的片段时，有专门的GC buffer，你试试看吧。
祝成功！
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2楼2014-10-11 14:57:42
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jian212

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-11 19:04:32
绕过高GC部分设计PCR引物
在前面取200-400的位置重新设计引物.
在不行的话直接找公司帮你试吧
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学习再学习，努力再努力。
3楼2014-10-11 15:46:51
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fanwq258

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-11 19:04:40
primerstar with GC buffer  你试试 我75%多的GC可以扩出来
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
4楼2014-10-11 16:08:28
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小刀188

金虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币-1, 应助指数-1, 屏蔽内容, 禁止发商业性质的回帖 2014-10-15 14:56:21
本帖内容被屏蔽
5楼2014-10-13 08:54:41
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313cr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lihe131 at 2014-10-11 14:57:42
我记得在扩GC含量高的片段时，有专门的GC buffer，你试试看吧。
祝成功！

试过了，P不出来
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6楼2014-10-13 16:47:50
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313cr

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jian212 at 2014-10-11 15:46:51
绕过高GC部分设计PCR引物
在前面取200-400的位置重新设计引物.
在不行的话直接找公司帮你试吧

我能说这个办法我也试过了吗，还是不行，经费有限，不让公司做，要自己P
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7楼2014-10-13 16:48:45
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意萧02

木虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2014-10-15 14:56:40
我的还82%GC,也是扩不出来，求交流

[ 发自小木虫客户端 ]
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8楼2014-10-13 17:17:35
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a1353601094

新虫 (初入文坛)
★
313cr(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-15 14:56:54
把这段序列设计成2个片段。5段GC高的那段弄出来单独PCR 温度高点。  后面GC一般的就正常扩  2个都扩出来后 跑胶回收  再拼全长。不知道这样可否。希望能帮到你
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9楼2014-10-14 21:03:07
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